重测序分析简介.pdf

重测序参考手册 目录 目录 1 1. 重测序简介 3 2. 重测序实验方法 3 基因组DNA 抽提 3 基因组DNA 样品建库 3 上机前定量 4 3. 重测序分析内容 4 重测序分析流程 5 重测序分析内容 5 4. 重测序重要技术参数 6 5. 重测序分析内容解释 6 6. 重测序分析内容示例 6 SNP 、INDEL 的样本差异分析 12 7. 成功分析案例/或已发表论文 14 8. 概念及常用工具链接 14 1. 重测序简介 全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上 对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单 核苷酸多态性位点（SNP ），插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异位点 （SV，Structure Variation ）位点。众信可以协助客户，通过生物信息手段，分析不同个体 基因组间的结构差异，同时完成注释。 2. 重测序实验方法 提取基因组 DNA，利用 Covaris 进行随机打断，电泳回收所需长度的 DNA 片段 （0.2~5Kb ），加上接头, 进行 cluster 制备（Solexa ）或 E-PCR （SOLiD ），最后利用 Paired-End 或者Mate-Pair 的方法对插入片段进行重测序。 实验步骤主要包括以下几点： 基因组DNA 抽提 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同 一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组 织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是 组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物 质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 基因组DNA 样品建库 这是样品准备过程中最主要的环节，也就是真正意义上的建库（通常我们所说的建库 包括整个样品准备的过程）。 样品片段化（Covaris ） Covaris 利用超声波剪切 DNA ，并将传统超声波法可控制化、精确化。 DNA 可以在 小体积中被剪切，减少了因为蒸发带来的样品损耗，并且被剪切的DNA 片段大小之间的偏 差较小。Covaris 剪切的片段大小较小，并且片段大小范围较传统超声波法窄。选择合适的 打断参数条件，使最后打断的DNA 片段大小集中在300-500bp 范围内。 末端修复 使用Covaris 剪切的DNA 片段都会形成一些杂合的末端，其中包括了3’ 端悬垂结构、 5’端悬垂结构和平末端。这些大小不一的悬垂结构还会存在一些并没有磷酸化的末端。本步 操作目的就是用T4 DNA 聚合酶和Klenow 酶将这些大小不一的悬垂结构补平成平末端。这 些酶具有 3端→5端外切核酸酶活性切除 3 端悬垂结构并具有聚合酶活性补平 5端悬垂结 构。另外，本步骤中T4 PNK 可以将片段5’端磷酸化。最后用AMPure XP Beads 对补平反 应体系进行纯化。 3端加A 反应 本步在补平片段的3’末端连接一个A 碱基可以减少在连接接头时片段之间的互连，并 且由于接头的 3’末端有一个独立 T 碱基，所以这一步的作用是在连接接头时，让接头与片 段之间特异性连接。 接头连接反应 本步在DNA 片段末端添加一个测序接头，该接头与flow cell 上的扩增引物相对应。 接头通过平末端连接在DNA 片段的两端，并且通过接头在flow cell 上进行桥式PCR 扩增， 形成测序簇。 纯化连接产物 连接反应结束之后用AMPure XP Beads 对补平反应体系进行纯化，最后用resuspension buffer 纯化至 20ul 的连接产物。用 2% 的琼脂糖凝胶进行电泳，切取所要求的片段大小的 DNA 片段，并用MInElute Gel Extraction Kit 进行回收。 扩增目的片段 本步通过PCR 反应扩增已连好两个接头的DNA 目的片段，PCR 引物对应着接头的末 端。本步PCR 使用高保真酶和尽