碱性纤维素酶产生菌的分离和筛选1.doc

碱性纤维素酶产生菌的分离和筛选 摘要：纤维素物质是自然界中最丰富的一种可再生资源，而有些菌类能产出纤维素酶，在纤维素降解为可利用能源上具有重要意义。纤维素酶主要来自于真菌和细菌。1 mg/ mL 的刚果红溶液,染色1 h ，弃去染液,加入适量1 mol/ L 的NaCl 溶液,洗涤1 h 。中间出现未被染红的白圈就是碱性纤维素产酶菌。 3.将能产生碱性纤维素酶的菌种进一步分离筛选。先从涂布的培养基上挑取单一的菌落，将其溶于少量无菌水中，再采用划线的方法挑取一环溶解的菌液在平板上分离纯化。37℃培养48h，如果48h后不能观察到明显的单个菌落，重复一遍。 4.在载玻片上滴一滴水，用接种环从平板中的单个菌落上挑取一些侵入水中，加入结晶紫溶液染色2min。用清水冲洗后滴加碘液，染色2min。用清水冲洗后再用乙醇冲洗，直到玻片上不再留有残余的染液，流下的水无色为止。最后用番红染色2min，用清水冲洗。涂面朝上，通过火焰2?~?3?次，烘干玻片在显微镜下进行观察。若为红色，为革兰氏阴性菌，若为紫色，为革兰氏阳性菌。 5.用接种环从平板中挑取单菌落后，在无菌水中涮洗下接种到100ml的液体发酵培养基中，另一瓶接入等量的无菌水作为对照。放入37°恒温震荡培养箱中进行培养，每隔一段时间取出进行OD值检测，以未接种的培养基液为对照。根据时间和吸光值的关系画出生长曲线。 三.实验结果 1.涂布平板的生长状况 由于发现10-4 10-6组中，菌不是太多，就是太少，透明圈不明显，所以实验结果均采用了10-5组的。 未加刚果红的平板，在黑框出，可以发现明显的透明圈。 加了刚果红染色后的平板，可以发现，这样可以更加明显的找到目的菌，其中的白圈很明显 划线分离纯化的最终结果，已经基本形成单菌落。 革兰氏染色后的结果，发现目的菌明显被染成了紫色，说明其为革兰氏阳性菌。 碱性纤维素酶产生菌在600nm下的吸光度 时间 0h 2h 4h 6h 17h 22h 47h 78h 93h 96h 121h 145h OD值 0 0 0.001 0.003 0.16 0.175 0.229 0.247 0.397 0.399 0.386 0.342 碱性纤维素产生菌的生长曲线 碱性纤维素酶产生菌不同时期的时间段 生长时期 迟缓期 对数期 稳定期 衰亡期 时间段/h 0-6 6-93 93-121 121 四.分析与讨论： 1.碱性纤维素酶的水解作用机制 在目的菌附近产生的抑菌圈是由于菌产生的碱性纤维素酶在碱性的环境下被激活，分解CMC-Na，由于CMC-Na被分解，于是培养基变得透明，，因为原来的浑浊状态是由于加了CMC-Na才导致的。根据透明圈的大小，可以判断出菌落产酶能力的高低。下面简单介绍下碱性纤维素酶的水解作用机制。 纤维素酶是具有不同底物特异性的多酶复合物，普遍认为是纤维素酶各组分协同作用的结果，其特异性水解纤维素(-1,4糖苷键的机制可以从下面图说明： 纤维素酶对糖苷键的水解主要通过酶活性中心的Asp或Glu上的羧基完成一个为解离的带负电荷的羧基，另一个为非解离的不带电荷的羧基： 首先，带负电荷的羧基对(-1,4糖苷键上的1号C进行亲核攻击，形成碳氧离子的过渡态； 其次，另一个非解离的羧基同时对(-1,4糖苷键上的O原子进行亲电攻击，形成氢键，使得(-1,4糖苷键上的C-O单键不稳定而断裂。 糖苷键的断裂而得到的其中一个葡萄糖残基和酶活中心的非解离羧基以氢键相连，很容易从酶分子上脱离，得到自由的葡萄糖残基和酶活中心的羧基。 最后，另一个葡萄糖残基的羟基以共价键和酶活中心的羧基相连，这种连接在另一个自由羧基的亲核攻击下断裂，酶分子被还原，并产生两个短的纤维素分子，酶水解完成。 2.目的菌的革兰氏染色与形态观察 通过2次的革兰氏染色，都发现其菌体被染成了蓝紫色，说明我们筛选出来的菌为革兰氏阳性菌。在通过高倍显微镜仔细观察其心态： 可以发现，其菌为圆形，有的2、3个连在一起，形态有点类似于金黄色葡萄杆菌的形态。但不能确定其确切的菌种名。 3.碱性纤维素产生菌的生长曲线 从生长曲线的图标中，可以看出，在0-6个小时内，菌液的OD值基本没有明显的改变，说明此阶段，接种进去的碱性纤维素产生菌还在适应环境，并没有开始大量的繁殖。这个阶段为迟缓期。在6到17h之间，OD值迅速上升，从0.003上升到了0.16 ，说明在这短短的11个小时之间，菌体开始大量的繁殖，大量的菌使培养基开始浑浊。在17到78h之间，菌液的OD值没有明显的上升，只是后期开始有小幅的振幅，因为此时，培养基中的菌体密度已经基本达到极限，菌体自身代谢的废物已经抑制其快速增值，其营养物质也不够其再继续大量繁殖了。在78到93h之间，菌液的OD值又开始