CHOM的分离纯化、活性及相对分子质量的测定.doc

CHOM的分离纯化、活性及相对分子质量的测定 李良康，崔巍，李碧琬，高佳佳 (河北大学 生命科学学院，河北 保定 071000) 摘要：目的纯化鸡蛋清中鸡卵类黏蛋白，并测定粗品和纯品中蛋白质的含量、分子质量、抑制活力；方法 用丙酮使得蛋清中鸡卵类黏蛋白沉淀，以DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化CHOM。以考马斯亮蓝法测定粗品和纯品中蛋白质的含量。紫外分光光度计测定其抑制活力;SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质的分子质量；结果 取得粗品溶液Vcrude=11.2mL，蛋白质含量=1.5259μg/μL,粗品的抑制活力为0.92*10-4U：.纯品溶液Vpurified=2.7mL,蛋白质含量=1.0940μg/μL. 纯品抑制活力0.99*10-4U，Mp=30903;结论 制备的鸡卵类黏蛋白不纯，SDS- PAGE电泳没跑开，显色不清晰。 关键词：鸡卵类黏蛋白、DEAE-纤维离子交换层析柱、抑制活力、考马斯亮蓝法、紫外分光光度计 【Abstract】Objective Purification of chicken ovomucoid egg, and determination of the content of protein, crude and pure product of molecular mass, inhibitory activity.Methods Put acetone into egg albumen preciptated CHOM,DEAE- cellulose ion exchange column chromatography purification of CHOM.The protein content in the crude and pure product was determined by coomassie blue staining.The inhibitory activity by Ultraviolet Spectrophotometry.Determination of molecular mass protein SDS- PAGE；Results The crude solution：Vcrude=11.2mL，protein content is 1.5259μg/μL，inhibitory activity is 0.92*10-4U 。The pure solution:Vpurified=2.7mL、protein content is 1.0940μg/μL,inhibitory activity is 0.99*10-4U,Mp=30903.Conclus CHOM impure preparation,SDS- PAGE did not well, color is not clear. 【Key Words】CHOM,DEAE- cellulose,SDS,inhibitory activity ,coomassie blue staining,Ultraviolet Spectrophotometry 鸡卵类黏蛋白是鸡蛋清中含有的一种蛋白质，其纯化常用离子交换层析方法[1]，具有较强的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶活性的研究。[2]SDS广泛用于测定生物蛋白的分子量，在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。[3]故可用SDS测定黏蛋白的相对分子量。 1材料与方法 1.1材料 新鲜鸡蛋，量筒（50mL），烧杯，离心管（1.5mL），透析袋，橡皮筋，DEAE-纤维素-32或DEAE-52，层析柱（1.0cm×20.0cm），微量进样器（50μL、100μL），培养皿（φ12cm），精密pH试纸，试管（18mm×180mm），滴管 1.2试剂 1.2.1粗提试剂 0.5mol/L三氯乙酸（TCA） TCA-丙酮溶液：0.5mol/L TCA与丙酮以体积比为1:4混合 0.2mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液 1.2.2纯化试剂 0．02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液（起始液）：0.2mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液稀释10倍 0.5mol/L氯化钠-0.5mol/L氢氧化钠溶液：1mol/L氯化钠溶液与1mol/L氢氧化钠溶液等体积混合 0.5mol/L盐酸 0.3 mol/L氯化钠或0.5 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液：在0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液中加氯化钠至浓度为0.3 mol/L或0.5 mol/L 聚二乙醇（或蔗糖） 1.2.3胰蛋白酶活力及黏蛋白抑制活力测定试剂 0.05 mol/L pH8.0