土壤微生物的分离纯化及鉴定.doc

土壤微生物的分离纯化及鉴定 一．摘要： 通过稀释涂布、划线分离等微生物的基本实验操作和步骤，对土壤中的微生物进行分离与纯化，再根据实验中菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化试验等结果对所分离细菌和霉菌的分类进行鉴定。 二．关键词： 土壤微生物，划线分离，纯化，芽孢染色，革兰氏染色，鞭毛染色，穿刺，生理生化鉴定 三．前言： 　　土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。土壤中尤以细菌最多，约占土壤微生物总量的70-90%.土壤中不同类型的细菌有不同的作用。有的能够固定空气中的氮元素，合成细胞中的蛋白质；有的能够分解农作物的秸杆，它们大多是异养菌。除了细菌以外，土壤中数量较多的其它微生物是放线菌和真菌，而藻类和原生动物等较少。土壤中的微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。 要研究某种微生物的特性或要确定某些微生物菌株的分类地位，首先须使该微生物为纯培养。也就是说培养物中所有的细胞只是微生物的某一个或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。 从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法和平板划线法是分离纯化微生物的常规方法。通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。 对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征性等。形态特征包括个体形态和培养形态。细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位都是个体形态的特点。培养形态指微生物在培养基（包括固体和液体培养）中生长的形态特征。通过细菌的形态特征可以对微生物进行分类鉴定。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的终产物的不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。. 四．实验材料 1.菌种： 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。. 3.溶液和试剂： 50%乙醇，20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油。 4.土样： 于山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表10cm下取得土样。. 5.仪器和其他用品： 普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试管，U型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。. 五．操作步骤 1培养基的制备与分装。 1.称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。 2.熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。 3.调pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至培养基所需pH。 4.分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培 养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。 5.加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。 2．无菌水的制备。 （1）用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。 （2）用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。 3．器皿的准备。 （1）培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。 （2）吸管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。 （3）玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。 （4）枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。 4．高压灭菌。 （1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113 ℃，30min灭菌）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 （2）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至50℃左右，倒平板。 5．微生物的分离与纯化。 制备土壤稀释液：称取10g土壤，放入灭好菌的无菌