使用及Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆.pdfVIP

。951· 2004：3l(10) 生物化学与生物物理进展 Prog。Biochem．Biophys． _————————————————————————————————————————————————————————一 陈其军1，2’ 安 瑞1’ 周海梦2’ 陈 珈1’ 王学臣1’” (1’中国农业大学生物学院，植物生理学与生物化学国家重点实验室，北京lo0094； 2’清华大学生物科学与技术系，北京100084) 摘要与cateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究，但应用这些载体系统的 一个瓶颈问题，是如何简单、经济和高效地将PcR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门 隆载体，用于在克隆PcR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆．利用兼容Gateway技术的7rA 克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题． 关键词Gateway克隆技术，TA克隆技术，入门载体，T载体，入门克隆 学科分类号Q78 入噬菌体依靠一套位点特异性重组系统整合到 Invitrogen公司开发了系列目的载体，包括适 细菌染色体中，并完成溶菌周期和溶源周期之间的 用于原核、酵母、昆虫和哺乳动物等不同宿主的表 转换¨2J．Invitrogen公司根据入噬菌体的这种位点达载体，大大提高了Gateway技术的适用性和兼容 特异性重组系统，开发了一套用于DNA体外重组 vectorconversion 的技术，称为Gateway克隆技术．Gateway技术是系统(Gateway system)，可以很方 一种通用性的克隆方法，利用该技术可以快速和高 便地将现有的载体系统改建为与Gateway技术兼容 效地将目的DNA序列同时构建到多种与Gateway的目的载体． Karimi等Ho以及cunis和 技术兼容的载体系统，用于功能分析和蛋白质表 达¨3．其基本过程可以表示为：聊tL×耐tR一眦tB了一套与Gateway兼容的植物双元表达载体．这些 +础P．为了利用Gateway克隆技术，首先需要将与Gateway兼容的农杆菌双元载体系统为高通量分 目的DNA序列按正确的方向和合适的读码框克隆 析植物基因的功能提供了有力的工具．我们已经获 到入门载体(entryvector)的两个attL重组位点之 间，获得入门克隆(entryclone)．入门克隆与含表达载体． 有两个attR位点的目的载体(destinationvector) 为了利用上述与Gateway兼容的农杆菌双元载 clonase 在LR enzymemix的作用下进行位点特异性 体系统，首先需要将目的DNA构建到入门载体上 重组，使得目的DNA序列按确定的方向和读码框 获得入门克隆．但如何简单、经济而高效地获得入 整合到目的载体上，获得目的克隆(destination门克隆是应用这些载体系统的一个瓶颈问题。为此 clone)．目的克隆可用于下一步的功能分析及蛋白 质表达． LRclonase enzymemix由整合酶(入门载体)．所谓TA克隆，就是将37端具有单个 host (integmse，Int)，宿主整合因子(integration A突出末端的PCR产物克隆到3’端具有单个T突 factor，IHF)和切除酶(excisionase，Xis)组 出末端的线性化的载体，即TA克隆载体或T载 成日o．与传统的克隆方法相比，Gateway克隆技术 体．TA克隆的理论依据是：在PcR扩增过程中， 的优点是：可以不必考虑目的DNA是否有合适的