细胞工程-第7章-干细胞.ppt

第 7 章干细胞与组织工程 学习须知 主要内容：干细胞培养的技术原理与方法，组织工程简介。 重点:干细胞培养的技术原理与方法； 干细胞(stem cells) 干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的祖先细胞。 干细胞的分类 胚胎干细胞 （embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞） 胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。 7.1 胚胎干细胞 胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。 7.1.1胚胎干细胞的研究概况 1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾脏被膜下得到了胚胎瘤细胞（embrynoic carcinoma cell, ECC）。 1981年，英国的Evans等用延缓着床的胚泡首次成功地分离了小鼠ES细胞，从而拉开了ES细胞研究热潮的序幕。 1995年，Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵长类动物的胚胎干细胞。1998年，他们从接受不孕症治疗的夫妇所捐献的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出了人的ES细胞。同年，Gearhart的研究小组从选择性流产所得到的胚胎生殖腺中分离出人EG细胞，研究证实这些细胞均具有全能性，掀起了ES细胞研究的高潮。 1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首 7.1.2 胚胎干细胞的生物学特性 　ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。 细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。 7.1.3 胚胎干细胞的全能性 (1)指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力。 (2) ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA）， 而且可以检查到OTC4基因的表达，这两种蛋白是发育全能性的标志。 (3) ES细胞的全能性的体现 可以形成畸胎瘤； 可形成类胚体； 可直接分化为特定种系的细胞； 可形成嵌合体。 畸胎瘤：由种质细胞或胚胎干细胞衍生而来的瘤性组织，排列结构错乱，往往含有外、中、内三个胚层的多种组织成分。 类胚体:是由胚胎干细胞在缺乏分化抑制剂的情况下形成的球状细胞团并相互融合的混杂集合体。 嵌合体：一种含有两种以上基因型组织的机体，可能是基因突变、染色体异常分离或移植的结果。 7.1.4 ES细胞的分化与调控 1. ES细胞的分化 ES细胞在体外极易分化。 ES细胞中碱性磷酸酶 （AKP ）及端粒酶活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。 把ES细胞与饲养层细胞共培养，可以抑制其分化，维持其稳定的增殖状态。解除共培养，则会导致ES细胞自发分化。 2. ES细胞分化的调控 （1）内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。 这种内源性调控主要来自ES细胞内所含蛋白（如结构蛋白等），以及部分转录因子。 （2）外源性调控 间质细胞的分泌因子，能维持ES细胞增殖分化等； 膜蛋白介导的细胞间互作（信号转导）影响ES细胞分化。 整合素与细胞外基质影响ES细胞的分布和分化方向。 7.1.5 建立胚胎干细胞系 1、分离ES 细胞 （1）ES细胞的主要来源：胚泡内的内细胞群和生殖嵴中的原始生殖细胞。 胚泡：桑椹胚的细胞在子宫腔内继续分裂，细胞数目不断增多，发育到第5天时已有100多个细胞，这时细胞重新排列成泡状。 生殖嵴：脊椎动物胚胎后半部，背系膜侧面中胚层形成的纵行上皮加厚的细胞条。可发育为生殖腺。 （2）ES细胞的分离方法： A: 免疫学方法 利用ES细胞所具有的特殊标记，借助荧光细胞分离器从单细胞悬液分离ES细胞。 B:免疫外科学方法 利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体与补体结合后所产生的对其它细胞的毒性杀伤作用，除去滋养层细胞，保留ES细胞。 聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团（inner cell mass，ICM），属于ES细胞，将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞