桦褐孔菌中小分子酚醛类物质的抗氧化活性.docVIP

桦褐孔菌中的小分子酚醛类物质的抗氧化活性 摘要 桦褐孔菌是一种药用真菌，他在俄罗斯的民间药方中具有广泛的应用，并且据说对人体的健康具有很多益处，比如说桦褐孔菌具有免疫调节和抗肿瘤活性。在本研究中，我们将桦褐孔菌的水提取物与其他几种药用真菌（姬松茸，灵芝和桑子菇）的水提取物的抗氧化作用进行了精确地对比，结果发现桦褐孔菌具有最强的过氧化物和羟自由基的清除能力。然后我们将桦褐孔菌的子实体与菌核分开，分别用80%的甲醇进行提取，结果显示桦褐孔菌子实体的抗氧化能力要远远高于菌核。最后，我们从桦褐孔菌子实体80%甲醇提取物中分离出了7种抗氧化成分，经过鉴定他们是以下几种小分子的酚醛类物质：4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸乙酯 2-羟基-1-羟甲基酯(丁香酸乙酯-2羟基-1-羟甲基酯，BAEE)，原儿茶酸（PCA），咖啡酸（CA），原儿茶醛（DB），2,5-二羟基对苯二甲酸（DTA），丁香酸（SA）和3，4-二羟基苯丁烯（DBL)。值得注意的是，BAEE是第一次从天然产物中分离并鉴定出来。 桦褐孔菌是一种分布于欧洲高纬度地区，朝鲜和日本的真菌，它通常寄生在白桦树的树枝上，一些黑色的，不成形的桦褐孔菌可以在树干上寄生10--15年，不过大部分的桦褐孔菌还是生长在白桦树的树枝上，也被称为白桦茸，已经被应用于传统的药方之中。近几年好多文献报道桦褐孔菌具有提升健康的作用，例如，保护DNA免受氧化应激的伤害，抗炎，止疼，抗肿瘤活性等。然而，除了一些萜类物质外，迄今为止还没有文献报道桦褐孔菌水提取物中活性成分的化学结构。 另一方面，众所周知，氧化应激反应会造成各种各样的疾病，如癌症，高血压，神经性疾病（阿尔茨海默氏症和帕金森氏症℃的冰箱中备用。 桦褐孔菌菌丝体和子实体提取物的制备 取桦褐孔菌子实体和菌核粉末各1g，分别将它们置于10ml的水中或不同浓度的甲醇水溶液中（20%，50%，80%的甲醇），室温过夜，3400rpm离心10min，取上清液保存在-20℃的冰箱中备用。 桦褐孔菌中抗氧化物质的分离与鉴定 活性物质纯化的步骤概述见表1，桦褐孔菌子实体粉末（干重320g）用80%的甲醇在室温下提取，甲醇提取物在室温条件下减压干燥，共得甲醇提取物（22.8g），然后将其溶于乙酸乙酯与水的混合液中，结果分散于水相的有10.2g（1-b），分散于乙酸乙酯中的有12.6g（1-a），把1-a溶液过一下HP-20甲醛系树脂柱，然后逐步洗脱，共得到五种成分（2-a-e），30%甲醇洗脱的为2-a，50%甲醇洗脱的为2-b，75%甲醇洗脱的为2-c，100%甲醇洗脱的为2-d，乙酸乙酯洗脱的为2-e，收集的2-a，2-b两种成分再利用HPLC做进一步的分离，（C-18反相制备柱，流动相为4%的乙腈，含有0.01%的TFA），得到了如下几种成分：化合物A,9mg；化合物B，20mg；化合物C,11mg，化合物G，11mg；用12%的乙腈洗脱得到了化合物D4mg和化合物E10mg，用12%的乙腈萃取2-b成分得到了化合物F53mg，纯化后的组分的化学结构通过NMR和MS来测定。 化合物B，C，D，E，F，G的评估通过HPLC来进一步的制备，并按照商业应用的各自可行的标准来进行，下面给出的NMR数据只是从天然产物中提取的化合物A的数据。 通过ESR（电子自旋共振）来测定抗氧化活性 根据文献报道的方法，将真菌的水提取物加入到反应体系中，以测定桦褐孔菌清除DPPH的能力。反应体系中的UV-H2O2系统会产生羟自由基。整个反应体系包括100ul的样品溶液，80ul150mmol/l的DMPO，120ul50mmol/l的H2O2，总体积为300ul，将混合液装入试管中，用254nm的紫外线照射5min，紫外照射完成1min后，通过ESR测定体系中的DMPO-OH信号。 超氧阴离子自由基清除能力的测定根据文献报道来进行。次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统作为超氧阴离子自由基的供体，PH=7.4的PBS缓冲液170ul，2mmol/l的次黄嘌呤160ul，10mmol/l的DTPA60ul，9.2mmol/l的DMPO20ul，然后边搅拌边加入各种浓度的样品液，然后加入0.4U/ml的黄嘌呤氧化酶160ul，将整个反应混合体系在室温下搅拌60秒，然后加入到分血计毛细管中，然后用ESR谱仪检测。 ESR谱利用 JEOL LES-TE 200 ESR谱仪在如下条件下测定：微波能量，8mV/MHz；微波频率，9.18GHz；调制幅度，0.1--0.2mT；时间常数，0.03s；扫描时间，0.5min；扫描字段，314.0加减10mT，扫描幅度，正负10mT。 清除DPPH自由基的能力 向80ul含有0.5mmol/l的DPPH溶液的乙醇溶液中加入80ul含有