下游实验内容-2017年10月.doc

实验一 牛奶中酪蛋白的制备 一、实验目的 1.学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。 2.了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。 二、实验原理 牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100ml。酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.25-1.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH值调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、原料与器材 鲜牛奶、恒温水浴锅、台式离心机、抽滤装置。 四、试剂 1.95%乙醇 2.无水乙醚 3.0.2mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液 A液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取NaAc.3H2O54.44g，定容至2000ml。 B液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。 取A液1770ml与B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。 4.乙醇-乙醚混合液 乙醇：乙醚=1：1（体积比）。 五、操作步骤 1.将5ml牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40℃，在搅拌下漫漫加入预热至40℃（应注意两种液体都应先预热至40℃再用），pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7(用1%NaOH或10%醋酸溶液进行调整)。观察牛奶开始有絮状沉淀出现后，保温一定时间使沉淀完全。 将上述悬浮液冷却至室温。离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。 2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上清液。 3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。 4.将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白精制品。 5.称取所获酪蛋白的质量（g）。 六、计算含量和得率： 酪蛋白含量（g/ml）=酪蛋白（g）/5ml×100%； 得率=测得含量/理论含量×100%。 七、实验注意事项： 1.离心管中装入样品后必须严格配平，否则对离心机损坏严重； 2.离心管装入样品后必须盖严，并擦干表面的水分和污物后方可放入离心机。 3.离心机用完后应拔下电源，然后检查离心腔中有无水迹和污物，擦除干净后才能盖上盖子放好保存，以免生锈和损坏。 八、思考题： 1.为什么调整溶液的pH可以将酪蛋白沉淀出来？ 2.试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验 。 实验二、双水相萃取相图的绘制及BSA分配系数的测定 一、实验目的 1.掌握绘制双水相相图的方法 2.理解双水相形成条件和定量关系 3.掌握PEG/无机盐体系双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（VT/VB）不同。相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。 pH值等。 三、实验材料及仪器 PEG1000原液（0.6g/m%，密度1.054）硫酸铵原液（0.g/mL，密度1.2）（μg/mL，pH8.0）紫外可见分光光度计2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。 以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系标准曲线的绘制：按下表加入试剂。摇匀。放置2min后测定595nm吸光度值。 （μg） mL PEG储液和4mL硫酸铵溶液于干燥的10 mL刻度试管中，再加入1 mL牛血清白蛋白溶液，混匀，以少量蒸馏水调节体系总质量为10g，混匀，静置15min，读取上下相体