不同浓度铜离子对金鱼的鳃、肠、脾病理影响的研究.ppt

 不同浓度铜离子对金鱼的鳃、肠、脾病理影响的研究  前言 铜是水生生物必需的微量元素之一,至少存在于30多种酶中作为氧化还原催化剂或氢载体。铜具有多种生理功能,与许多生化过程密切相关,对血红蛋白合成、细胞呼吸和生物防御等有重要作用。在渔业生产中铜也是使用时间最长、应用最广泛的药物之一。特别在鱼苗生产中应用更多，可以防治疾病，也可以作为除藻剂，杀死或去除丝状藻等浮游植物。同时，较多的鱼用药物添加了铜以增加药效。 一．试验的目的和意义 目前应用较多的有硫酸铜、 碱式硫酸铜、螯合铜等,它们的共同之处在于最终起作用的都是铜离子,但是当铜离子浓度超过水生动物的生态幅度时则会引起水生动物中毒。除导致鱼等水生生物急性中毒死亡之外，还会经常发生慢性中毒而影响鱼类的生长、繁殖和抗病力。由于铜制剂使用不当等原因水生动物铜中毒现象屡见发生。 在动物铜中毒的研究上，关于畜禽和水生生物的报道很多，其中有关于鱼类的报道则侧重于铜的毒性大小、鱼类在中毒以后的临床表现的描述，系统的病理学研究却很少。 二.实验材料与工具： 金鱼、自来水、苏木素、钾矾、蒸馏水、碘酸钠、水合氯醛、柠檬酸、 伊红、 95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、甘油蛋白等 解剖用具、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、移液管、纱布、牛皮纸、标本瓶、塑料圆筒、染色架、电炉、小捞网、充氧设备、显微镜、轮转式切片机、照相机等 三：实验内容： 试验采用容积约50L的塑料方形塑料箱，将试验用鱼随机分成9个试验组和一个对照组。每桶倒入20L洁净自来水，用CuSO4 ·5H2 O配制浓度分别为1.69mg/ L（Ⅰ组） 、 2.00mg/ L（Ⅱ组） 、2.36 mg/ L（Ⅲ组） 、2.78 mg/ L（Ⅳ组）、3.29 mg/ L（V组） 、3.88 mg/ L（VI组） 4.58 mg/ L（VII组） 、5.40 mg/ L（VIII组） 、6.00 mg/ L（IX组）的药液，再设一个对照组，同样放20L自来水。由于试验条件有限，每个桶只能放十条金鱼，并放置一个气石充氧。 三 组织切片的制作过程 组织固定 脱水透明 浸蜡 包埋 切片 染色 观察 拍摄 三 组织切片的制作过程 （1）处理载玻片 将新载玻片散放于烧杯中，加入适量洗衣粉，加自来水，用电炉加热煮沸15～20min，小水流冲洗24h，用滤纸擦干放在盒子里备用。 （2）固定 将解剖出的组织用纱布包裹，系口，置于固定液（10%的甲醛）中，固定24h后取出将组织修整为合适的小块，方便彻底脱水，并换固定液，再固定24h （3）冲洗 把固定完成的标本瓶倾斜放置在水槽中，瓶口盖上纱布一来可以防水锈及水中其它杂质，二来在冲水时防止组织从标本瓶中掉出，自来水小水流冲洗24h。 （4）脱水和透明 水洗后的材料要经过脱水和透明过程，脱水的过程在于用乙醇完全除去组织内的水分。 脱水的步骤是由浓度较低的酒精开始，逐渐转入高浓度的酒精中。具体操作如下：将冲洗后的组织移入70%酒精12h→80%酒精12h→90%酒精1.5h→95%酒精1.5h→100%酒精（Ⅰ、Ⅱ）各1h→无水酒精和二甲苯（1：1）混合液10min→二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各20min。 （5）浸蜡与包埋 提前一天将熔点为56℃的石蜡放入烧杯，置于恒温箱60℃，进行融蜡，融蜡的时间长点比较好，这样可以充分的释放石蜡内的空气，在石蜡凝固后不容易产生气泡。组织脱水后放入二甲苯和石蜡（1：1）混合液1h→石蜡Ⅰ70min→石蜡Ⅱ70min。在脱水之后，由于酒精不能与石蜡融合，要用二甲苯把酒精替换出来,然后再逐步将二甲苯除去以石蜡代之。。 6）包埋 包埋是把浸好蜡的组织块转入包埋的石蜡中，使其冷却凝固形成包有组织的蜡块。最好让组织悬浮在合适的位置。 （7）修整蜡块 修成以组织为中心的“凸”形蜡块，凸面为切面。修整成便于切片的小块。 （8）切片和展片 石蜡切片常用的是手摇切片机。切片厚度设置为4～6微米，开始切片。若是气温太低可以在切片机旁边开一个电炉，这样更容易切出完整的切片。待切出完整组织后，用镊子轻轻夹取薄片，置于水浴锅中（42℃）展平。待蜡片的褶皱完全展平时将此薄片平铺于涂有甘油蛋白，的载玻片上，用滤纸吸去多余水分，平放在染色架上，转入恒温箱(60℃)放置4h，使组织与玻片充分融合 （9）切片的染色处理 取染色架放入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各10min→100%、95%、90%、80%、70