清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定-2017年10月.docVIP

清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定 芽孢杆菌是大曲中常见微生物，也是重要类群之一。地衣芽孢杆菌一直以来被认为是酱香型白酒高温大曲中特有的微生物，就我们研究发现，在牛栏山酒厂生产用的多种清香大曲、出池酒醅中同样存在地衣芽孢杆菌，对分离出23株芽孢杆菌进行生理生化实验，鉴定出12株地衣芽孢杆菌，鉴定结果与中国食品发酵工业研究院分子鉴定结果一致。本文主要介绍地衣芽孢杆菌的生理生化鉴定实验方法，为地衣芽孢杆菌的鉴定提供比较完备的一套方法。1 地衣芽孢杆菌的分离1.1材料牛栏山酒厂生产用清香大曲、酿酒车间酒醅1.2分离用培养基肉汁培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，pH 7.0-7.2，121℃，灭菌30min。1.3分离方法取大曲干粉或酒醅0.5g，加入带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇床培养30min，60℃水浴30min，然后用接种环蘸取，在肉汁培养基平板上划线分离。挑取单菌落继续划线分离，直到得到单菌落纯菌株为止。2 地衣芽孢杆菌生理生化鉴定实验根据上述分离培养基和分离方法，共计分离得到芽孢杆菌23株，编号分别为1＃、2＃、3＃、4＃……22＃、23＃，接下来通过实验对这些菌株进行筛选和鉴定。地衣芽孢杆菌鉴定参考《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英等编著）的方法，有所改进，以下为具体的生理生化实验鉴定方法。2.1柠檬酸盐与丙酸盐利用实验某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯一碳源，并利用磷酸铵作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。培养基配方：柠檬酸钠（或丙酸钠）0.2％，NaC1 0.5％，MgSO4?7H2O 0.01％，(NH4)2HPO4 0.1％，K2HPO4?3H2O 0.1％，1%溴百里酚蓝水溶液10ml，琼脂2％。以上成分除指示剂外其余加热溶解，调节pH＝6.8-7.0，并加入指示剂，使培养基呈草绿色，分装试管，灭菌后摆斜面。取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3-7d，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者为阴性。只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸钠，为阳性反应，而其他芽孢杆菌均不能利用丙酸钠，为阴性反应，但很多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠。 2.2产酶实验2.2.1过氧化氢酶实验过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。将芽孢杆菌接种于肉汁培养基斜面上，适温培养18-24h。取干净的载玻片，在上面滴1滴3-5％的H2O2，挑取1环培养18-24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接加到菌种斜面上，观察气泡的产生。 2.2.2淀粉酶实验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为无色糊精等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不变蓝色。培养基：在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃ 20min灭菌备用。卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。将灭菌后放入培养基冷却到50℃左右，倒成平板，凝固后，取18-24h的纯培养物点于平板上，每皿可点种3-5个菌株，适温培养2-4d，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为阴性。透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。2.2.3 纤维素酶实验采用刚果红染色法，如果有刚果红存在，刚果红可以与纤维素结合成红色螯合物，培养基颜色为红色。如果培养基中有能够产纤维素酶的细菌，将纤维素分解，不能形成螯合物，在菌落周围形成透明圈。这样可以鉴定产纤维素酶的细菌。培养基的配制：CMC-Na 5-10g，酵母膏 1g，KH2PO4 0.25g，琼脂15g，将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml，加入5ml 10mg/ml的刚果红溶液，121℃，灭菌20min，冷却倒平板，凝固后待用。取18-24h的培养物点于平板上，每皿可点种3-5个菌株，适温培养2-4d，形成菌落后，观察产生透明圈情况，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈，否则为阴性。2.2.4明胶液化实验明胶是一种动物性蛋白，明胶的水解是由于有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。明胶培养基本身低于20℃凝固，高于24℃则自行液化。明胶分解后，其分子变小，虽在低于20℃的温度下也不再凝固。培养基：蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000ml，调节pH7.2-7.4，分装试管，培养基高度约4-5cm，115℃ 20min灭菌。挑取18