5-分子生物学研究方法-2017年10月.ppt

第五章 分子生物学研究方法 5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术 目的基因的来源 原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA文库 人工合成及PCR扩增目的基因 噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 质粒：10kb λ噬菌体：23kb 黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb 5.2.1 细菌转化 常用的转化方法： 化学转化（CaCl2）法 电击法 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。 电击转化： 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 克隆的筛选： 抗生素基因。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等 ?-互补蓝白斑筛选 营养条件（自养、异养） 　 　 ?-互补筛选 β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒 编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞 IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑 蓝白斑筛选 Lac Z , IPTG  X-gal X + gal  （白色） （蓝色） Lac Z（失活） , IPTG  X-gal X-gal  （白色） （白色） 蓝白斑 转化率的计算： 转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积） 插入频率＝白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数 转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数） 5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术 1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法 原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n 倍 反应体系 模板DNA：待扩增的目的片段 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶 dNTP 含有Mg2+的缓冲液 PCR技术在基因克隆方面的应用 （1）目的基因的直接克隆， （2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆； （3）制备DNA探针，进行分子检测等。 构建步骤： 1、载体和受体的选择 文库中筛选目的基因 5.4 SNP技术应用 （single nucleotide polymorphism）单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换 应用：遗传病研究、动植物遗传育种 SNPs的研究意义 1. SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。___路标的作用 传统研究策略（表征、蛋白、基因） 逆向遗传学（表型、基因、蛋白）， 2.基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别） SNPs研究进展和方向 1. SNPs数据库的构建发现 2. SNPs功能的研究（在1的基础上） SNPs检测方法 1.理想的检测SNPs的方法 ——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs (1) 灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧） (2) 快速、简便、高通量 (操作和分析的自动化程度高） (3) 费用相对低廉 2.现状： 到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。 3.每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段