DGGE操作步骤.doc

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项 一、实验试剂及配置 1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1） 试剂 用量 丙烯酰胺 38.93g 双丙烯酰胺 1.07g MilliQ（超纯水） 水 加到100mL 溶液采用0.45μm滤膜过滤，储存在4℃ 2、0％的变性储存液 凝胶梯度 6％ 8％ 10％ 12％ 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺 15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液 2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水 83mL 78mL 73mL 68mL 总容积 100mL 100mL 100mL 100mL 3、100％的变性储存液 凝胶梯度 6％ 8％ 10％ 12％ 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺 15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液 2mL 2mL 2mL 2mL 去离子甲酰胺 40mL 40mL 40mL 40mL 尿素 42g 42g 42g 42g MilliQ 水 加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL 4、50×TAE缓冲液 试剂 用量 终浓度 Tris碱 242.0g 2M 冰乙酸 57.1 ml 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水 加到1000.0mL 将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温 5、银染液的配制: 原液：8×固定液（250 ml）： 乙醇 200 ml 冰乙酸 10ml MilliQ 水 40ml （A）：1×固定液（400 ml）： 8×固定液 50ml MilliQ 水 350ml （B）银染溶液(400ml)： AgNO3 0.6g MilliQ 水 300ml （C）：显影剂（500ml）： NaOH 4.5g MilliQ 水 300 ml 甲醛 0.9ml 6、10％过硫酸铵（APS）： 过硫酸胺 0.3g 超纯水 3.0ml 溶解后使用0.45μm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。 7、10ml DGGE加样缓冲液： 2％溴酚蓝 0.25ml 2％二甲苯青 0.25ml 100％甘油 7 ml MilliQ水 2.5ml 二、不同引物的变性梯度 1,乳杆菌（380bp） 变性梯度 0%变性储存液 100%变性储存液 TEMED 10%过硫酸铵 35％（12ml） 7.8ml 4.2ml 13ul 56ul 65％（12ml） 4.8ml 7.2ml 13ul 56ul 2,双歧杆菌（596bp） 变性梯度 0%变性储存液 100%变性储存液 TEMED 10%过硫酸铵 40％（12ml） 7.2ml 4.8ml 13ul 56ul 70％（12ml） 3.6ml 8.4ml 13ul 56ul 3,肠球菌（300bp） 变性梯度 0%变性储存液 100%变性储存液 TEMED 10%过硫酸铵 40％（12ml） 7.2ml 4.8ml 13ul 56ul 55％（12ml） 5.4ml 6.6ml 13ul 56ul 4,V3 region（217bp） 变性梯度 0%变性储存液 100%变性储存液 TEMED 10%过硫酸铵 35％（12ml） 7.8ml 4.2ml 13ul 56ul 65％（12ml） 4.2ml 7.8ml 13ul 56ul 60％(12ml) 4.8ml 7.2ml 13ul 56ul 5,V6-V8 region (489bp） 变性梯度 0%变性储存液 100%变性储存液 TEMED 10%过硫酸铵 42％（12ml） 7ml 5ml 13ul 56ul 58％（12ml） 5ml 7ml 13ul 56ul 浓缩胶： 0%变性储存液 7ml， TEMED 8ul， 10%过硫酸铵 36ul 三、实验操作 1．封槽 （1）用95 %乙醇擦净清洗一大，一小两块玻璃板，干燥