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标记的二抗 处理过的印迹 处理 指示一抗的位置 抗体复合物 待研究的蛋白质的位置 该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。 不足：标记二抗用于多种不同特异性一抗 避免了标记很多一抗的需要 二抗可以增强信号 所以一般情况下都釆用间接法进行检测。 前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。 洗涤液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时多次的洗膜比长时少次更有效,要严格保证反应时间。 第3步TBST洗涤是为了洗去膜上的Tween20，因为它可以阻碍底物的沉积。 * 3. 转膜(Transfer) 毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。 * 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 * 湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用的大胶比较困难。 湿转操作步骤： 1、起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形。 2、润湿：准备2张Whatman 3#滤纸、1张NC膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些）， NC膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用PVDF膜，应先在100%甲醇中浸泡，否则很难润湿。甲醇可反复利用。） 3、三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层Whatman 3#滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极） 切记：每层之间用滴管/玻棒将其中的气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！ 4、转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 ℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。 关于转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA,上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 关于转膜的注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极； 2.转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放4 ℃ 冰箱； 4.滤纸不要大过膜，防止短路； 5.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全； 6.注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉； 7.在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 * 半干转移用浸透缓