大规模动物细胞培养技术.ppt

大规模细胞培养需要解决的问题 营养成份 杂交瘤细胞培养时使用的血清中的各种蛋白是单抗纯化的主要障碍 杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM?F12，DMEM?F12?RPMI 1640 无血清培养基用于杂交瘤细胞培养有它的固有优点，也有它的不可避免的缺点，如需要对每个细胞系优化配方， 添加成本很高的激素和生长因子，导致长的迟滞期，降低细胞生长速率、最大细胞密度和细胞活性等 逐渐形成了以胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠为基础添加剂的各种无血清培养基配方，进而通过合理解决铁离子的传递问题，开发出了无蛋白培养基 胰岛素是杂交瘤细胞的重要生长因子，能够刺激葡萄糖的利用及RNA、蛋白和磷脂的合成 转铁蛋白是一种结合铁的糖蛋白，在无血清培养基中是一种重要的生长刺激蛋白 乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，与细胞内的磷脂合成有关 亚硒酸钠中的硒作为一种微量元素，是一种谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，拥有抗过氧化物的能力，因而可提高杂交瘤细胞在无血清培养基中的生长速率及活性 多数细胞系需要脂类维持在无血清培养基中生存，常见的添加脂类为胆固醇、低密度脂蛋白、大豆磷脂和亚油酸或油酸 所需微量元素：铁、硒、铜、铝、锰、钒、锌等；无蛋白条件下长期培养往往还需要添加铷、锆、铬、镉、钴、镍、硅、锡、锗等 无血清培养基中常见的其他添加物质包括：?-巯基乙醇、氢化可的松、维生素C、生长因子和抗氧化剂等 营养成份－其他需要注意的要点 提高培养细胞的接种密度； 选择合适的抗流体剪切保护剂，在含血清培养时选用的保护剂未必在无血清培养时适用； 选择合适的生物反应器，使剪切作用更小，控制精度更高； 添加更丰富的氨基酸和维生素； 定期检查杂交瘤细胞的遗传特性，特别是分泌单抗能力的变化，必要时进行重新克隆或用新的种子； 建立液氮冻存细胞的方法和程序； 细胞培养用的容器要更加洁净，水和化学品的纯度要更高； 培养基的储存期要短，储存时应避免反复冷冻或pH的大幅度波动。 反应器参数的优化 温度：最适合的细胞生长温度，产物表达最适合温度或者会有，需要进行摸索。对反应器而言需要做到控制的温度精度高，还需要有编程控制能力。 溶氧控制：细胞在对数生长期、产物表达期、连续培养还是分批培养等不同情况下，对溶氧饱和度的要求不一样，需要进行摸索和优化。对反应器而言，由于与溶氧相关的因素较多，如Air，O2，N2所以一个好的反应器必须有很好的气体混合控制功能，还需要保证溶氧控制的温度和编程控制能力。 杂交瘤细胞对pH非常敏感。通常的pH控制范围为7.0—7.2，但实际上pH偏低一些比偏高一些对细胞的影响要小。对反应器而言，需要配置很好的pH控制系统，如CO2和Na2HCO3的级联控制，需要保证pH的精度。 剪切力对动物细胞的作用及细胞保护 在生物反应器中，机械搅拌和气泡都会给杂交瘤细胞带来损伤，降低细胞活性 最为严重的是，在培养基中运动的气泡常会吸附大量细胞于气液界面，在其运动特别是聚并和破碎时，会严重破坏细胞，造成对细胞活性的严重影响 通常血清对细胞有较好的保护作用，表面活性物质，如Pluronic F68，通过阻止细胞在气泡表面的吸附，从而达到保护细胞免受气泡损伤的目的。其它的一些大分子聚合物也对细胞有一定的保护作用。但Pluronic F68这类保护剂对某些细胞的生长有抑制作用 对反应器而言，解决的方案是：1、采用低剪切力的搅拌桨；2、采用无泡通气系统或者在大反应器中采用微泡通气系统。 能源和碳源物质的利用和有害副产物的形成 杂交瘤细胞生长的主要能源物质和碳源物质是葡萄糖和谷氨酸胺。 由于杂交瘤细胞不正常的代谢途径，葡萄糖通常经过糖酵解过程转化为丙酮酸，然后还原为乳酸，一般培养基中50?80% 的葡萄糖转化为乳酸，而乳酸对细胞生长和抗体合成有一定的抑制作用，特别是会引起培养基pH值的下降。高的葡萄糖浓度常会造成乳酸的快速积累 ，所以采用流加或补加葡萄糖的方法可降低乳酸的积累 谷氨酰胺本身是一种很不稳定的氨基酸，它在培养基中可化学分解为吡咯烷酮羧酸和氨。在细胞代谢过程中，谷氨酰胺也产生大量的氨和乳酸 。氨对杂交瘤细胞有较强的毒害作用。通常采用谷氨酰胺浓度限制的方法降低氨的生成或采用各种方法从培养基中除去氨。 由于糖酵解和谷氨酰胺代谢遵循不同的途径，因此培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的比例也必须调整到一个合适的值。需要摸索不同生长期和表达期对葡萄糖和谷胺酰胺的不同需求量。 对反应器而言，为了避免葡萄糖和谷胺酰胺在代谢过程中产生的副作用，必须要配有高效率的灌注系统，一边把代谢废物排出反应器，一边把新鲜营养成份补充进来。 可以配备生化分析仪在线