卫生化学第8章 液相色谱法.ppt

* * 连续展开需在特制的展开缸中进行，将薄层板顶部敞于缸外，溶剂上升到板顶部即向外界不断挥发，它是不增加板长而改进分离的一种方法。双向展开所用薄层板为正方形，将试样点在板的一角，先向一个方向展开至前沿后，取出板挥干溶剂，再用另一种溶剂于前次展开的垂直方向以同样方式再展开一次，这种方法分离效果较好。 * * 当用混合溶剂展开时，要防止产生“边缘效应”（edge effect）。边缘效应是指同一组分的斑点在薄层中部比在边缘移动慢的现象。 规定展开高度 溶剂前沿 展开方向 边缘效应 * * 由于展开缸中混合溶剂未饱和，极性弱的溶剂在两边缘处易挥发，使展开剂组成与中部不同，边缘处含更多极性大的溶剂，洗脱能力强，因此Rf值较大。 防止 “边缘效应”方法：用展开剂饱和展开缸和薄层板。 可用在展开缸内衬一滤纸以加速溶剂蒸发饱和，并将薄层板两侧边缘吸附剂刮去1～2 mm。 * * 4．显色 展开后的斑点若没有颜色，则需用显色方法定位。常用方法有： （1）紫外光照射法 在紫外光（常用汞弧灯）照射下，如样品能产生荧光，可观察荧光斑点；若样品不产生荧光而吸附剂中含荧光物质（如硅胶GF254），则板上显荧光，而斑点为暗色。 * * （2）气熏显色法 将几粒碘置于密闭容器中，待碘蒸气饱和后，将展开后的干燥薄层板放入，碘与化合物可逆地结合，斑点显淡棕色。薄层板取出后，碘即升华逸出。因此显色后应立即标记斑点。 （3）喷洒显色剂法 软板一般采用湿态显色，硬板应在溶剂挥干后才喷显色剂显色。此法显色后的物质已被破坏，不能再行回收。 * * （五）定性定量分析 1．定性 薄层色谱法根据样品与纯品的Rf值对照定性。由于Rf值受很多因素影响，在同一色谱条件下，不同的化合物可能有相同或相近的Rf值，而且Rf值的测量不可能很精确，重现性较差，文献查得的Rf值只能作定性参考。 * * 实际工作中，是将样品与纯品于同一薄层板上，以完全相同的条件操作，根据测得的Rf值进行对照。并且还须以二种或多种色谱条件进行核对确认。也可采用相对比移值Rs确认。 * * 2．定量 （1）目视比较定量法 在同一薄层板上比较样品和纯品斑点大小及颜色深浅，估计样品的大概含量。（半定量） （2）洗脱法 用适当的方法将斑点位置的吸附剂全部取下，用溶剂将组分洗脱下来，再用光度法或其它分析方法定量。此法要求斑点无拖尾，组分洗脱率要高，比较麻烦费时。 * * 目前，应用较普遍、快速而准确的定量方法是薄层扫描定量法（Quantitation by TLC Scanning）。 * * （六） 薄层扫描法 1．基本原理 它是利用专用的薄层扫描仪，以一定波长的单色光测定薄层色谱斑点的吸光度A或荧光强度F随展开距离l的变化，记录A～l或F～l曲线（称为薄层扫描色谱图），利用薄层扫描色谱图的峰面积对物质进行定量分析。 * * （七）高效薄层色谱法 高效薄层色谱法(High Performance Thin–Layer Chromatography，HPTLC)是在薄层色谱的基础上，采用较细颗粒（5～7 ?m）的吸附剂，用喷雾法制成均匀、致密的高效薄层。展开距离短（约为3～7 cm），展开时间少（只须2～30 min）。用自动点样器点样，自动喷雾器或碘蒸气发生装置显色，扫描仪定量。 * * 由于高效薄层色谱法使用的薄层板与操作方式比经典薄层法更加规格化，所以它具有分析速度快、分离及分辨效率高、检出限低（可达ng～pg级）、斑点集中及试样不受沸点和热稳定性的限制等优点。其操作条件的选择也较灵活，因而可与高效液相色谱互补，是分离复杂混合物的有效方法之一。 * * （八）薄层色谱法应用 样品用量少，分离效果好，分析速度快，仪器和方法简单、价格较低，发展很快，应用范围非常广泛。被药检、法检、临检以及卫检等部门列为标准方法。如食品中营养成分及有害物质黄曲霉素等的定性、定量分析；临床医学的妊娠早期快速诊断；毒物与麻醉药巴比妥、大麻、鸦片、生物碱及残留农药的定性、定量等等。 * * 二、纸色谱法 纸色谱法是以纸为载体的平面液相色谱法。 * * （一）方法原理 纸色谱法的固定相为结合于滤纸纤维的水，在吸附于纸纤维上20 %～25 %的水分中，有6 %左右的水通过氢键与纤维素上的羟基结合，形成液液色谱中的固定液。流动相为与水不相混溶的溶剂。当流动相携带样品通过纤维间毛细作用（上行）及重力作用（下行）向前移动时，利用不同组分在两相间分配系数不同，产生差速迁移而彼此分离。 * * 所以纸色谱法属分配