第11章 微生物细胞破碎.ppt

第二章 回顾 发酵液的特性 预处理的目的 改善发酵液过滤特性的方法 发酵液的相对纯化 影响固液分离的因素 过滤（分类、常用过滤器）； 离心分离（分类、常见离心分离设备） 第十一章 微生物细胞破碎 表3.1(续) 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物 概述 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎主要采用各种机械破碎法和非机械破碎法，或二者的结合。 机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力。 化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压的作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 第一节 细胞壁的组成与结构 一、细菌细胞壁 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分，结构为机械性强度很大的网状结构。 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。 革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，网状结构较坚固；革兰氏阴性细菌的网状结构较疏松。 二、酵母菌细胞壁 酵母菌细胞壁比革兰氏阳性细菌要厚，但不及革兰氏阳性细菌细胞壁坚韧。 酵母菌细胞壁破碎的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 霉菌细胞壁 霉菌中大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的。 细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁要高。 细胞壁结构与细胞破碎 破碎细胞必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。 细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。细胞个体小，球形，壁厚，聚合物交联程度高是最难破碎的。 微生物细胞壁的组成和结构取决于遗传信息、培养的生长环境和菌龄。霉菌的细胞壁结构随培养过程中机械搅拌作用的强弱而变化。所以，通过改变遗传密码或培养的环境因素可改变细胞壁的结构。 细胞破碎的原则 ?需通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作条件，获得最佳的破碎效率。 在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标生化物质，而使其他物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，在保证目标生化物质有较高收率的前提下，使下游加工过程的成本最低。 选择性地释放目标生化物质的关键是要根据目标生化物质的性质和在细胞内存在的位置来选择适当的破碎方法和操作条件。 选择性地释放目标生化物质？ ①仅破坏或破碎存在目标生化物质的位置周围： 当目标生化物质存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶解法、渗透压冲击法和冻结 - 融化法等。 当目标生化物质存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法， 产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 。 ②选择性溶解目标生化物质： 当目标生化物质处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调整溶液 pH 值、离子强度或添加与目标生化物质具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等,使目标生化物质容易溶解释放。 所选的溶液体系应使其他杂质不易溶出。 第二节 常用破碎方法 按其是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类 高速湿法珠磨法和高压匀浆法已经在工业生产中广泛应用， 酶解法和化学溶胞法也大量应用于实验室规模的细胞破碎中， 超声破碎法和微波破碎法的实验室研究开发相当活跃。 表3.3 细胞破碎方法分类 机械破碎 机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快,主要靠均质作用和球磨碾磨作用； 操作时，细胞遭受强大的机械剪切力而被破碎。 采用机械法，发热是一个主要问题 其次，不容易规模放大。 细胞的机械破碎主要有: 珠磨 高压匀浆 超声波破碎 X-press法 等方法。 珠磨法 工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径﹤1mm）一起快速研磨或搅拌，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器作用下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 过程中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。 珠磨法破碎细胞分为间歇或连续操作。 珠体的大小应以细胞大小、浓度以及连续操作时不使珠体带出作为选择依据。珠体的装量要适中。 装量少时，细胞不易破碎； 装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温度升高。 珠磨法 提高细胞破碎率的措施： 延长研磨时间、 增加珠体装量、 提高搅拌转速 提高操作温度 高破碎率带来的问题: 能量消耗大大增加 产生较多的热能，增大了冷却控温的难度； 大分子目的产物的失活损失增加； 细胞碎片较小，分离碎片不易，给下一步操作带来困难。 所以，不仅要考虑总收率，而且要兼顾下游过程。 珠磨