第5章 凝胶过滤层析.ppt

Enter presentation date 第五章 凝胶过滤层析 Test 第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 第二节 基本原理 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 柱体积 柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。 外水体积 简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000 （二百万）溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。 内水体积 Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积计算 5.2.3.3 GF分辨率 分辨率（分离度）Rs用于描述混合组分中两种物质组分间分离效果的好坏，定义为相邻两峰洗脱体积（保留值）之差与两峰底宽平均值之比， 如要提高分辨率，只能从选择性和柱效进行考虑! 选择性：柱系统分离大小不同组分的能力。习惯上用相对保留值表示，取决于凝胶介质的分级范围、渗透性等特性。 柱效 以特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示 理论塔板高度H 第三节 凝胶过滤介质 5.3.1凝胶过滤介质的基本结构 介质的结构和性质直接决定分离效果和效率 5.3.2凝胶过滤介质的参数及性质 5.3.2.1基本参数 粒度5~400 μm范围 小粒度—柱效高，但背景压力大，设备要求高，分析型 大粒度—柱效低，压力小，样品量大，制备型 粒度均一——分离效果好 交联度高，颗粒网孔小，机械强度高 膨胀度：每克干胶溶胀过程中吸收水的体积ml/g，也称得水值 交联度高，得水值越小（水分子无法大量进入颗粒网孔之间） Sephadex系列的表示方法（下文详解） 5.3.2.3机械强度 与交联度呈正相关 5.3.2.4物化稳定性 耐酸碱、去污剂、高温等外界分离条件 下文按照以上几个主要反映凝胶过滤介质性质的指标介绍主要的GF介质类型。 5.3.3凝胶介质的主要类型 5.3.3.1交联葡聚糖凝胶（Sephadex） 基本性质 由数个葡萄糖分子聚合而成的同多糖就是葡聚糖，通过环氧丙烷交联而成交联葡聚糖凝胶。具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。 葡聚糖凝胶常用G-X代表， Sephadex GX ，X为凝胶吸水值的10倍； Sephadex GX，X—每10g干胶的得水值（ml/10g） 种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200。 如G-25表示1g干凝胶的吸水量为2.5mL，G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。 X数字既代表持水量（得水值），也代表交联度，也能反映膨胀程度和分级范围。 X数字越小，得水值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。适用于分离低分子质量生化产品。 X数字越大，得水值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大，适用于分离高分子生化产品。 特点 较强的亲水性 溶胀、浸泡时沸水（脱气）、轻搅（防裂） 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温 SephadeX LH—20，是Sephadex G—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 机械强度低，G100、150、200属于软胶，高压易破裂 5.3.3.2琼脂糖凝胶（Sepharose） 琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用。 Sepharose 无交联剂，Sepharose 2B、4B、6B，数字代表琼脂糖含量，含量高则强度高，分级范围变小 pH4-9范围内的盐溶液稳定 40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理 补充： 瑞典的商品名称为S