.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数.pptVIP

一、课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 脲酶 + CO2 NH3 +H2O 1、实例： 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，提供有利于目的菌株生长的条件。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 ㈠.筛选菌株 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？ 固体培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖 唯一氮源：尿素 选择培养基 培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解利用尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 3、培养基选择分解尿素的微生物的原理 选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 （1）将土壤中的固氮菌分离出来 （2）将土壤中自养微生物分离出来 举一反三 （3）筛选出抗青霉素的微生物 （4）筛选出耐高浓度食盐的微生物 …… 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ㈡.统计菌落数目： 计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积（1 mm2）和高（0.1 mm）的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或者25个）小格，但计数室都是由400个小格组成。 计数室 ②操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下统计4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。 ③计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ㈡.统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点： 2.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法： 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。 （2）原理： 稀释涂布平板法。 说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足条件的是对照组，未满足条件的是实验组。 ㈢.设置对照： 判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。 判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（牛肉膏蛋白胨固体培养基）与 选择培养基接种后培养观察菌落数目。 小结：对照组虽然不直接影响结果，但实验结论要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样 从富含有机物、潮湿、 pH≈7的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。