第二章 酶工程2—酶的生产和分离纯化.ppt

第二章 酶工程——酶的生产和分离纯化 Contents of chapter 2 　　1.对酶源的要求 　　2.微生物作为酶的优势 　　3.对酶生产菌的要求 1.对酶源的要求 　1）酶含量丰富 　2）提取、纯化方便 2.微生物作为酶的优势 　1）微生物种类多，易得到所需的酶类 　2）可以控制微生物培养条件，易获得高产菌株 　3）生产成本低 　4）微生物繁殖快、生长周期短 　5）生产易管理 　6）提高微生物产酶能力的途径较多 　7）微生物易改造，可提高酶产量或改造酶 3.对酶生产菌的要求 　1）不是致病菌，也不产毒素 　2）不易变异退化，不易感染噬菌体 　3）产酶量高，而且最好产生胞外酶 　4）原料廉价，周期短，易培养 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 五、酶的分离方法 影响蛋白质盐析沉淀的因素 　a.蛋白质的浓度:2.5-3.0% b.介质的pH:接近等电点 c.温度:一般在室温，特殊在4度 d.盐类型:单价盐很差 　　空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。 影响因素 a. 蛋白质的分子质量——大，沉降好 b. 蛋白质浓度: 浓度高，易于沉淀；太高，分段作用减弱 c. pH值:接近等电点 d. 离子强度:低离子强度影响不大，过高影响分段效果 e. 温度: 0－30度 f. PEG聚合度:越高，用量越少；过高操作不便，多用PEG6000 等电点沉淀法 　　蛋白质在等电点（ｐI）处，净电荷为0，易于沉淀。 热变性沉淀法 　　可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。 4、层析分离 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） 　加入1%~2%的SDS制备而成。 　 SDS－PAGE主要用于测定蛋白质的分子质量。 　基本原理： 　　　SDS－蛋白质复合物中SDS含有大量阴离子，从而掩盖了蛋白质之间原来的电荷的差异；而且蛋白质构象发生改变变成椭圆形，短轴为18埃左右，长轴与蛋白质分子质量成正比－－－ SDS－蛋白质复合物的迁移率不再受其原在电荷和分子形状的影响，而只决定于蛋白质的分子质量。 六、酶的浓缩、干燥与结晶 过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 反渗透膜 生物小分子、盐、离子 20? 反渗透 超滤膜 病毒、生物大分子等 20?～0.2μm 超滤 微滤膜、微孔陶瓷 细菌、灰尘等 0.2～2μm 微滤 滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等 2μm 粗滤 过滤介质 截留的主要物质 截留颗粒大小 类别 膜分离 加压膜分离 微滤 超滤 反渗透 电场膜分离 电渗析 离子交换膜电渗析 扩散膜分离 透析 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 亲和层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 凝胶过滤层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 离子交换层析 分离依据 层析方法 4、层析分离 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换层析 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。 凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 凝胶过滤层析 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进