细胞工程学 第2章.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 无机离子：除Na、K、Ca、P等大量元素外，还需一些微量元素，如Cu2﹢、Zn2﹢、Fe2﹢等。 碳水化合物：细胞生命的能量来源，也有一些是蛋白质和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠、醋酸钠等。 其它成分 抗氧化剂如抗坏血酸、谷光甘肽等 三磷酸酰苷（ATP） 辅酶A 核酸降解物如嘌呤与嘧啶类 （3）合成培养基的分类 生长培养液 用以维持细胞生长增殖。含血清比例大，是培养工作中最主要的培养用液，其组成为： 基本培养基 80%～90% 血清(多用小牛血清) 10%～20% 抗生素(多用青霉素100u/ml和链霉素100u/ml) 维 持 液 维持细胞缓慢生长或不死，血清含量很少，一般细胞因缺少生长因子时不能增殖，生长缓慢，但发生转化或癌细胞因自身有产生促生长增殖因子的能力，在血清缺少情况下仍能生长；可用于选择发生恶性转化的细胞。 其组成为： 基本培养基 95% 血清 2%～5% 注意：如果培养正常细胞完全不加血清，可维持细胞不死，但时间过长细胞难免退化。 合成培养基的种类 Eagle，s、Dulbecco，、Ham，s、CMRL、 RPMI、Waymouth，s、 MoCoy，s、Iscove，s MEM 、F12、 1066 、 1640 、 MB 751/1 、 5A 、 DMEM? L15、 NCTC109、 199、 Fischer …… 5、无血清培养基 血清在体外培养细胞中提供细胞增殖所必需的生长因子，大多数动物细胞体外培养都不同程度依赖血清才能生长增殖。但血清的成分也很复杂，能直接影响实验结果。 血清中还有一些有害物和抑制物，对细胞有去分化的作用，影响细胞的功能表达。因此，许多研究工作需要在培养基中不含血清和其他天然培养基。 无血清培养基研制难度大，要设计出一种万能的无血清培养基非常困难。 继续设计新的、能适应多种类型体外生长增殖的无血清培养基。 在研究生长因子等工作的基础上，向人工合成培养基内补加一定的激素、生长因子等已知物质来支持细胞的生长和增殖。 无血清培养基设计趋势 6．其它常用液 （1）消化液 分离组织和分散细胞用的。 如：胰蛋白酶、胶原酶、二乙胺四乙酸二钠（EDTA）。 胰蛋白酶 采自牛或猪的胰脏,易潮解，置于阴暗干燥处保存。 主要作用：水解细胞间蛋白质，使细胞相互离散。 活力表示：以解离酪蛋白的能力表示。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和特性有密切的关系。浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力最大，但超过一定限度也会损伤细胞。 胰蛋白酶溶液在pH7.2，温度为37℃时，作用能力最强。此外，钙、镁离子和血清蛋白的存在会降低其活力。 **胰蛋白酶溶液用无钙、镁离子的溶液进行配制。 **消化时加入一些血清或含血清培养液，可终止胰酶的作用。 胶 原 酶 胶原酶的主要作用是使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞离散。胶原酶消化的不是细胞表面，而是细胞间质。胶原酶大多是从芽孢杆菌中提取出来的。胶原酶在Ca2+和Mg2+存在下仍有活性，血清亦不能抑制其活性，故消化后应充分漂洗。 比较：胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别 项目 胰蛋白酶 胶原酶 消化特性 适用于消化软组织 适用于消化纤维多的组织 用量 0.01% ~ 0.5% 0.1 ~ 0.3mg/ml （200U/ml） 消化时间 0.5 ~ 2小时（小块） 1 ~ 12小时 PH 8 ~ 9 6.5 ~ 7.0 作用强度 强烈 缓和 细胞影响 时间过长有影响 无大影响 血清抑活 有 无 Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响 EDTA 主要作用：EDTA为化学螯合剂，能螯合钙、镁离子, 对细胞有一定的解离作用，毒性小，价格低廉，使用方便。常用浓度一般为0.02%，配制时用无钙、镁离子的溶液溶解，高压消毒灭菌分装入小瓶中，置4℃冰箱保存。 （2）pH调整液 主要作用： 维持培养液pH稳定、维持渗透压、提供能源。 NaHCO3 NaHCO3单独配置、消毒灭菌，常用浓度7.4%、5.6%、3.7%三种，配制时用三蒸水溶解，滤过除菌，分装小瓶，盖紧瓶塞