走进分子生物学实验室.ppt

模板中含有杂蛋白质，含有Taq酶抑制剂，模板核酸变性不彻底，忘加Taq酶或溴乙锭，引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体 * 走进分子生物学实验室 ——分子生物学实验室常用设备和仪器介绍 孙文 宋田源 培养箱 常用培养箱一般为隔水式恒温培养箱 细菌——37℃ 霉菌——28℃ 使用时注意培养箱的水位，水位过低会引起温度变化幅度加大，不能控温 冰箱 4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。 -20℃适用于酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。 -80℃适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理感受态等的保存。 0-10℃的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 摇床 分为恒温式和常温式 用于大肠杆菌，酵母菌等生物工程菌种的振荡培养及蛋白的诱导表达，培养通常为37℃和28℃ 烘箱 用于灭菌和洗涤后的物品烘干 有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干；用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干。 高压蒸汽灭菌锅/箱 主要用于能耐高温的物品，如培养基、金属器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡胶及一些药物的灭菌。 压力升至103.4kPa，温度达121.3℃，维持15~20分钟，可达到灭菌目的。 电子天平 按照最大称量的不同分为超微量（2-5g），微量（3-50g），半微量（20-100g）等规格 使用前需要检查是否水平 称量时需要称量纸，决不允许直接称量 称量腐蚀性和吸湿性物质时需要用烧杯称量 pH计 玻璃电极平常不用时应浸泡在蒸馏水中。 甘汞电极在初次使用前，应浸泡在饱和氯化钾溶液内，不要与玻璃电极同泡在蒸馏水中。不使用时也浸泡在饱和氯化钾溶液中。 磁力搅拌器 在配置试剂过程中，有些试剂较难溶解，这时需要借助磁力搅拌器。磁力搅拌器可以加速溶解固体内容物。磁力搅拌器一般带加热功能。 电炉和微波炉 生物安全柜和超净工作台 PCR仪、PCR反应及结果检测 聚合酶链式反应 高温变性 低温退火 中温延伸 基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 优点 特异性强 灵敏度高 简便、快速 纯度要求低 PCR仪类型 普通和梯度PCR仪 荧光定量PCR仪 原位PCR仪 PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物（终浓度） 各100～250μmol/L 引物（终浓度） 各5～20μmol/L 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 5～10 U Mg2+（终浓度） 1～3mmol/L 补加双蒸水 100 μl  参加PCR反应的物质 引物 DNA聚合酶 dNTP 模板链 缓冲体系 引物设计原则 ①引物长度：15-30bp ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 ③引物内部不应出现互补序列。 ④两个引物之间不应存在互补序列 ⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70% ⑥引物3’端应严格要求配对，引物的5’端可以修饰。 循环数 一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加。 结果检测 荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳 荧光探针 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳（水平） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（垂直） 蛋白质的凝胶电泳（SDS） 凝胶制备和电泳过程 制作胶模 融化琼脂糖，冷却后加入EB 倒模，加入TEB缓冲液 加样 电泳（电压1-5V/cm） 成像观察 常见问题 假阴性 阴性 假阳性 非特异性扩增带 片状拖带和涂抹带 That’s all 95℃高温时变性会变成单链低温（经常是55℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5’-3’）的方向合成互补链。 * Taq和Pfu Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能 * 95℃高温时变性会变成单链低温（经常是55℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5’-3’）的方向合成互补链。 * Taq和Pfu Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能 * 模板中含有杂蛋白质，含有Taq酶抑制剂，模板核酸变性不彻底，忘加Taq酶或溴乙锭，引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体 *