DNA或RNA原位杂交.PPT

基因探针 基因探针又称核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异性相互作用的标记分子. 也就是指一段能识别(与目的序列或靶序列互补)特异性碱基序列(基因)的标记同位素等标记物的单链DNA或RNA的分子。 杂交类型 固相杂交 液相杂交 核酸分子杂交(固相杂交) Northern 杂交 Southern 杂交 芯片 以上方法决定杂交模板核酸性质, DNA Southern 杂交. RNA Northern 杂交 探针与核酸杂交的方法 1）斑点杂交(dot-blot) 2）菌落/噬菌斑：转印筛选法 3）组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(in situ hybridization ISH) . Southern-blot(DNA)、Northern-blot(RNA) DNA和RNA操作基本一样，只是电泳所用的胶有所不同(RNA易形成二级结构) 原位杂交(in situ hybridization ISH) 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。 硝酸纤维膜(NC膜) 硝酸纤维膜有两种; 0.22μm孔经 0.45μm孔经 转印 虹吸印迹法 电转移法 DNA片段大小影响转移速度. 预杂交 用DNA酶I消化并变性的小牛胸腺DNA或鲑精DNA封闭膜. 杂交液 5XSSC 20mmol/L鳞酸缓冲液 (pH7.0) 5XDenholdt氏液 10% 硫酸葡聚糖 100μg/ml变性小牛胸腺DNA或鲑精DNA . 50% 甲酰胺 洗涤液 2XSSC, 0.5%SDS 5min. 2XSSC, 0.1 % X SDS 15 min.(室温). 0.1XSSC, 0.1 % X SDS 37 °C 30min至1h. 0.1XSSC, 0.1 % X SDS 65 °C洗涤30min至1h.( 水浴) 显影(放射性,非放射性) 原位杂交技术的基本方法： (一),杂交前探针种类选择。 (二),杂交前探针标记方法选择。 (三),探针的纯化。 (四),杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理，增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等。 (五),组织的前处理。 (六),预杂交。 (七),原位杂交。 (八),杂交后处理(漂洗)。 (九),杂交后显色。 原位杂交固定 目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。 固定剂 最常用多聚甲醛固定组织。醋酸酒精的混合液和Bouin′s固定剂也能获得较满意的效果。 mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1~2 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在- 7 0℃。 如冰箱温度恒定，在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。  杂交 杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片 ,加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。 玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。 杂交后漂洗 杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高漂洗。 显示 显示又可称为检测系统(Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射 自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。 非特异性染色 非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也