乳酸乳球菌启动子一信号肤活性片段在大肠杆菌中的克隆和表达.pdfVIP

遗 传 学 报，24(5):471-479,1997 ActaGeneticaSinica 乳酸乳球菌启动子一信号肤活性片段 在大肠杆菌中的克隆和表达 还连栋 孙汉珍 陈秀珠 庄增辉 薛禹谷 中（国科学院微生物研究所 北京 100080) 摘要 利用闪PB14为启动子一信号肤序列探测载体，在大肠杆菌中克隆乳酸乳球菌总DNA 中具有启动子一信号肤功能的DNA片段。共得到42个具有红霉素、氨节青霉素双重抗性的 转化子。转化子的氨节青霉素抗性水平在100-800伽g/ml之间，p一内酞胺酶活力大多积 累于周质空间，说明重组质粒中的外源插人片段确实具有发动转录和促进分泌的功能。 Southern杂交结果表明，插入片段的确来源于乳酸乳球菌总DNA，其大小在80-400bp之 间。DNA序列测定发现pSEQ8和pSEQ12中插人片段分属于pSEQ4和pSEQ17插人片段的 一部分。在测序的4个DNA序列中都找到了启动子和起始密码子。其中2个含有典型的S. D.序列和非典型的信号肤序列，其他2个则没有发现典型的S.D.序列和信号肤序列。另外发 现启动子上游序列对启动子转录起始的效率具有促进作用。 关键词 乳酸乳球菌，启动子与信号肤序列，大肠杆菌，基因克隆，DNA序列分析 乳酸乳球菌L（actococcuslactis）是广泛应用于食品工业的一类重要工业菌株。由于 下述原因使它继大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌之后而为人们关注的一个新热点。(1) 乳酸乳球菌有许多染色体外因子，如质粒和噬菌体，为发展乳酸乳球菌基因克隆的载体系 统提供了丰富的材料；(2)它很容易在实验室条件下生长、繁殖，可作为厌氧型革兰氏阳性 菌的研究模型，且在乳酸乳球菌中建立起来的许多遗传学手段可以推广应用于乳酸菌的其 他属，甚至其他革兰氏阳性菌；(3)更重要的是，乳酸乳球菌作为一种食品级微生物具有作 为遗传工程宿主菌来生产、分泌自身或异源蛋白质的巨大潜力4[1［。因此，研究和了解乳酸乳 球菌基因表达、调控和蛋白质分泌机制，不但有其理论意义，而且有重要应用价值。 近些年来，有关乳酸乳球菌生理、生化和遗传学背景知识增长很快，体外克隆技 术也有了较大发展，但对它的蛋白质分泌机制的研究报道很少。为了研究乳酸乳球菌 基因表达和蛋白质分泌的机制，构建乳酸乳球菌分泌型表达载体，本文利用启动子一 信号肤探测载体pGPB14，在大肠杆菌中克隆和表达了乳酸乳球菌染色体上具有启动 转录、促进分泌功能的DNA片段，并对克隆片段的功能和DNA序列作了分析。 1 材料和方法 1.1 材料 中国科学院 “八五”重点科研项目 本文于1996-01-25收到，1996-08-06修回 472 遗 传 学 报 24卷 表1 菌株和质粒 Table 1 Strainsandplasmids 菌株或质粒 性状和遗传型 来源 Strainorplasmid Propertiesandgenotype Source 乳酸乳球菌 HX-2-17 NP+NlsrSuc+ 本实验室 L lacticHX-2一17 Thislab. 大肠杆菌 HBlal supE44hsdS20(rBmB)recAl3ara14proA21acYl 本实验室 E.coliHB101 gaIK2rpsL20xyl-5mtl一1 Thislab. 大肠杆菌 DH5a supE44AIacU69(D(801acZAM15)hsdR17 本实验室 E.coliDH5a