魅力pcr-全式金.pdf

魅力PCR—— 酶与缓冲液的珠联璧合 北京全式金生物技术有限公司 上篇 PCR历史与原理 PCR酶分类 PCR酶性能 下篇 反应体系与条件的优化 特殊要求的PCR 常见问题与对策 PCR历史与原理 PCR与Mullis 1972 U.C. Berkeley 博士学位 1979 进入Cetus公司 1983 “顿悟”PCR原理 1986.6 首次将Taq 酶应用于PCR 1986.9 离开Cetus 1993 诺贝尔化学奖 PCR原理 PCR：Polymerase Chain Reaction——聚合酶链式反应 核心：耐热DNA聚合酶 PCR酶分类 A型、B型DNA聚合酶三维结构 Kohlstaedt L A,Wang J,Friedman F M,Rice P A and Steitz T A,1992.Cristal structure at 3.5 angstrom resolution of HIV-1 reverse transcriptase complex with an inhibitor.Science,256:1783~1790 提出了HIV-1 RT酶的右手结构模型 手掌：催化磷酸转移 手指：与合成中引入的核苷酸相互作用 拇指：与模板相互作用 Thomas A. Steitz,1999.DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms,JBC 将该模型推广到所有DNA聚合酶 A型、B型DNA聚合酶三维结构 3’-exo的位置不同 A型聚合酶（Taq 酶系列） 高扩增产量（≤5 kb） 较低的保真性 3’-A 具有5’ -3’外切酶活性，用于探针法的荧光定量 宽泛的反应条件 对抑制物（盐、血、酚等）敏感 难以扩增复杂模板（高GC、二级结构等） B型聚合酶（Pfu 酶系列） 高热稳定性 高保真性（3’→5’ 外切酶活性） 低扩增产量 反应条件较苛刻 复合酶 Barnes, W. (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from l bacteriophage templates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2216–2220 一定比例A型聚合酶与B型聚合酶的混合物 （或用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代B型聚合酶） 高扩增产量 高合成长度 保真性介于二者之间（3’→5’ 外切酶活性） A型酶 B型酶 复合酶 扩增效率 高 低 高 合成长度 较短（5kb ） ？ 长 保真性 差 好 介于A 、B之间 5’→3’外切酶活性 有 无 有 3’→5’外切酶活性 无 有 有 产物3’末端 3’-A 平末端 3’-A 反应条件 宽泛