大肠杆菌基因组测序.PPT

基因组测序与组装 1) 基因组测序的策略 2) 基因组测序的方法 3) 高通量自动化测序 4) 序列组装 基因组测序的策略 1) 随机测序 2) 限定测序 随机测序 1) 基因组文库构建 2) 两端测序 3) 为何要两端测序 随机测序原理 基因组测序的方法 1) 测序的DNA多聚酶; 2) 测序标记; 3) 电泳装置; 4) 测序难点. 测序的DNA多聚酶 目前普遍采用的测序酶为Sequenase, 来自T7噬菌体 荧光标记电泳测序 毛细管电泳测序 毛细管 第一代和第二代DNA测序-中断测序连续测序 焦磷酸测序技术 pyrosequencing 焦磷酸测序技术是一 种新的实时DNA?测序 技术。它在DNA?聚合 酶、三磷酸腺苷硫酸 化酶、荧光素酶和三 磷酸腺苷双磷酸酶 4?种酶的协同作用 下，使引物延伸聚合 脱氧核糖核酸.?dNTP 释放焦磷酸盐PPi、 PPi转换为三磷酸腺 苷（ATP）、ATP?产 生荧光信号与dNTP 和ATP?的降解等化学 反应偶联起来，检测 结果准确可靠。 循环阵列测序--滚环扩增建库cyclic-array sequencing 测 序 文 库 构 建 循环阵列测序-PCR建库 Polymerase colony, or polony,technologies perform multiplex amplification while maintaining spatial clustering of identical amplicons. In emulsion PCR (ePCR), a waterin-oil emulsion permits millions of noninteracting amplifications within a milliliter-scale volume . Amplification products of individual compartments are captured via inclusion of 1-mm paramagnetic beads bearing one of the PCR primers . Any single bead bears thousands of single-stranded copies of the same PCR product, whereas different beads bear the products of different compartmentalized PCR reactions . The beads generated by ePCR have highly desirable characteristics: high signal density, geometric uniformity, strong feature separation, and a size that is small but still resolvable by inexpensive optics. 循环阵列测序-富集与测序芯片制作 循环阵列测序—焦磷酸测序 循环阵列测序—碱基读取 几种不同生物基因组的测序 1) 大肠杆菌基因组测序----图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 3) 果蝇基因组测序---鸟枪法 4) 人类基因组测序---图位法和鸟枪法 4) 拟南芥基因组测序—图位法 5) 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法 大肠杆菌基因组测序（1） 大肠杆菌基因组（C区）测序 大肠杆菌C区测序采取了分割染色体DNA 的技术, 将切离的一段染色体DNA与人工插 入的复制载体整合, 获得可独立扩增的克隆 片段用于鸟枪法测序. LoxP-Cre重组系统 大肠杆菌基因组C区测序步骤(1) 大肠杆菌基因组C区测序步骤(2) 线虫基因组测序策略---图位法 注: 线虫为单性(X或Y)或雌雄同体(XX), Y染色体未测序. 流感嗜血杆菌基因组鸟枪法测序流程 用于测序的流感嗜血杆菌基因组文库 构建了两套基因组文库: 1) 1.6-2 kb大小插入子基因组文库. 2 kb大小插 入子可减少扩增时的变异率. 此外, 2 kb大小 降低了克隆片段含有完整基因的可能性,有 些完整基因的表达产物对宿主菌是有害的. 2) 15-20 kb大小插入子文库, 用于支架搭建. 上述两套基因组文库的克隆测序均为两端 测序. 流感嗜血杆菌基因组鸟枪法测序