DNA合成原理DNA合成原理.ppt

寡 聚 核 苷 酸 背景介绍 寡核苷酸的化学结构 寡核苷酸的用途 寡核苷酸的化学合成原理 寡核苷酸的纯化方法 DNA的化学结构 双连螺旋结构 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径 核 酸 A （腺嘌呤）、G （鸟嘌呤）、C （胞嘧啶）、 U （尿嘧啶）、T （胸腺嘧啶） 核苷酸 脱氧核苷酸 核 苷 磷 酸 戊糖：核糖 碱基：A 、G 、C 、U 脱氧核 苷 磷 酸 戊糖：脱氧核糖 碱基：A 、G 、C 、T Base=A, G, C, T Base=A, G, C, U 脱氧核苷酸 核苷酸 T 胸腺嘧啶 Thymine A 腺嘌呤 Adenine G 鸟嘌呤 Guanine U 尿嘧啶 Uracil C 胞嘧啶 Cytosine G 鸟嘌呤 C 胞嘧啶 T 胸腺嘧啶 A 腺嘌呤 寡聚核酸的用途 PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变 基因建构（全基因合成） 反义核酸   多聚酶链式反应PCR：Polymerase Chain Reaction PCR是由美国科学家穆利斯(Kary Mullis)提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 基本反应步骤 ：高温变性 → 低温退火 → 适温延伸。 寡核苷酸的化学合成原理 目前，oligo DNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱保护、耦连、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去，最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较稳定的优点。  该方法的特点： • 第一个核苷酸是3’固定在固相载体上 • 每一个核苷酸依次连接上去 • DNA合成的方向是3’→5’ • 合成是在疏水环境中进行 dA-phosphoramidite dT-phosphoramidite dG-phosphoramidite dC-phosphoramidite 1. 脱DMT （Detritylation） CPG：Controlled pore glass，可控微孔玻璃珠，作为寡居核苷酸依附的 固体载体。 2. 耦连 （Coupling） 活化 （Activation） b. 耦连 （Coupling） 3. 加帽 （Capping） 耦连中未反应核苷酸链 已加帽核苷酸链 4. 氧化 （oxidation） 核苷酸的纯化方法 在所有合成循环结束后，就得到一个目标DNA片段粗品，首先需经过氨解步骤，然后再通过各种方式进行纯化。 氨 解 切 割：将合成好的寡聚核苷酸从固体载体（CPG）上化学切割下来。 常用新鲜的浓氨水来裂解CPG 上连接化合物与初始核苷间的 酯键。 脱保护基：将合成好的寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉。 一般用新鲜的浓氨水来处理较长时间以脱掉氰乙基（P）、苯 甲酰基（ dA、dC）、异丁酰基 （dG）。 纯 化 C18柱脱盐纯化 OPC 纯化 PAGE 纯化 HPLC 纯化 C18柱脱盐纯化 C18柱上一种活性炭柱子，又称为简易反相柱，它对DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱， 所以能有效地去除盐分。 优点：所有纯化方法中最简单的一种。 缺点：不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成 效果很好时才能选用此法。 OPC 纯化 利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂， 合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT，所有合 成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有 DMT片段的吸