pcr快速侧乙肝pcr快速侧乙肝.ppt

PCR方法快速检测HBV 指导教师:于红 张文卿 学 生:刘晓林 王远贺 王瑞静 一、实验背景知识 1、HBV与乙型肝炎 【HBV结构】 【HBV致病性】 HBV传播乙型肝炎的四种传播途径为: 1、血液、血制品等医源性传播 2、母婴传播 3、生活密切接触传播 4、性传播 HBV与肝硬化、原发性肝癌关密切！ 【乙肝现状】 乙肝广泛流行于全世界，迄今为止，尚未发现无HBsAg阳性携带者地区。全世界60亿人口中有3.5亿人为HBsAg携带者，其中78%分布在亚太地区。我国HBsAg携带人口在1.2亿，占全世界HBsAg携带人口的1/3。根据我国肝炎调查结果，估计我国乙肝病人约有2700万人，每年新发病人约有900 万。 乙肝已经成为全世界的健康杀手！ 2、PCR 【PCR概念】 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 【PCR反应特点】 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 同时需要指出的是，由于PCR的高度灵敏性，在实验中易出现假阳性的情况，所以不单独作为检测HBV的方法。 【 PCR技术的应用】 1.遗传性疾病的基因诊断 2.传染病的诊断(肝炎病毒) 3.癌基因检测 4.法医学(亲子鉴定)上的应用 5.DNA测序 6. 基因克隆 7.引入基因点突变,基因融合等 【血清HBV DNA检测】 血清HBV DNA是HBV感染、复制、血液有传染性的直接标志。 实验者综合PCR实验的优缺点，实验条件，选择应用PCR检测HBV。 二、实验原理 【PCR反应成分】 1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2+等。 本次实验PCR反应组成 二.【PCR反应基本步骤】 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s） 变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。? 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） 延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、?Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。? 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。?? 本次试验PCR反应循环参数 94℃5min 94℃1min 53℃1min 30个循环 72℃1min 72℃10min 三、实验准备 【实验材料】： 引物：5`—TGACAAGAATCCTCACAATA—3` 5`—AGCCCTACGAACCACTGAAC—3`(扩增HBV的S基因，产物长度493bp) Pure ddH2O 10xbuffer 10xdNTP 25mM MgCl2 TaqDNA聚合酶 溴酚蓝 溴化乙锭 TBE缓冲液 琼脂糖 阳性标本一例 待测标本两例 阴性标本一例 【实验仪器】： PCR扩赠仪 水平式电泳槽 紫外透射仪 凝胶成像分析仪 微量加样器等 四、实验步骤