动物克隆与转基因克隆技术.ppt

动物克隆与转基因克隆技术 基本概念 克隆：克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“Klone”，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。在大陆译为“无性繁殖”在台湾与港澳一般意译为复制或转殖或群殖。 个体克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。 细胞克隆：干细胞 分子克隆：PCR 质粒扩增 克隆发展的简单历史 1938年德国汉斯·施佩曼提出采用细胞核移植技术克隆动物的设想 ； 1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙 ； 1963年，中国童第周教授 获得胚胎细胞核移植鱼； 1964年，格登（J.Gurdon)获得体细胞核移植非洲爪蟾 ； 1981年 ，卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。 1984年，施特恩·维拉德森 获得胚胎细胞克隆羊； 1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛； 1997年2月，英国罗斯林研究所wilmut博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功 ； 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多利”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。 “檀香山技术” ； 2001年，克隆欧洲盘羊，但盘羊克隆成功后仅活了7个月。 克隆技术的问题 流产率高，胎儿畸形，出生率低5%，出生体重过大！重编程（epigenetic reprograming）不完全是关键！ 发生充分的NEBD和PCC的灵长类SCNT胚胎高达20%能发育至囊胚(Mitalipov, Zhou et al. 2007)。 Sung的研究结果却表明PCC不是牛体细胞重编程的必需条件(Sung, Shen et al. 2007) 在NT牛胚胎1、2、4细胞检测到的hnRNA明显高于IVF胚胎，NT胚胎的基因转录在1细胞阶段发生，此亦反应出供体细胞的基因表达并没有完全被终止。 在正常的受精卵发育中，牛、猪、小鼠、大鼠和人类受精后父源DNA发生快速的主动去甲基化，同时母源DNA随着复制发生被动去甲基化(Xu et al. 2005)。 牛的父源染色体去甲基化后，很快开始从头甲基化（de novo），在2细胞期前甲基化水平恢复至和母源DNA相同的甲基化水平(Park, Jeong et al. 2007)。 牛在8-16细胞期，在DNMT3A和DNMT3B酶的作用下，染色体重新从头甲基化，胚胎建立起新的甲基化模式(Dean et al. 2001)。随后胚胎染色体的甲基化模式由DNMT1维持，它决定着早期胚胎基因表达的程序性启动。 推测 转基因克隆动物的优点 转基因的效率高：理论上讲100%后代是转基因动物； 大大降低了转基因动物的生产成本，减少了受体使用； 缺点：核移植胚胎移植后妊娠率低、流产率高。 * * 动物克隆的一般技术流程 转基因克隆动物的基本流程 细胞筛选 基因整合 MSTN基因 基因转移 同源重组 核供体猪 体细胞 细胞培养 卵供体猪 未受精卵 除去卵核 细胞融合 克隆胚胎 胚胎移植 无核卵子 代孕母亲 基因组经过同源重组修饰的转基因克隆猪 同源重组细胞扩增 1998年日本克隆牛 1997年英国克隆羊 1998年新西兰的克隆奶牛 1998年美国克隆小鼠 动物克隆回顾 1998转基因克隆山羊米拉 1999年杨向中 美国 1998年日本转基因克隆奶牛 2002年美国克隆猫科比 2000年美国克隆猪 2000年，猕猴特拉 2000年英国基因打靶polly 2002年法国克隆兔 2001年意大利 欧洲盘羊 155d异种克隆 2001年，亚洲野牛诺亚 2002法中克隆大鼠 15次入宫 2002年法国克隆兔 2003年美国克隆骡 2003年意大利克隆马 2003 南韩克隆狗 2002年英美双敲除基因打靶猪 2003美野猫 2003美克隆鹿 2004年克隆水貂 2005年韩国克隆狼 2005年10月1日出生的 广西大学体细胞克隆水牛 将来某一天 Overall Growth Placental Insufficiencies Cerebral Effects 早期胚胎发育的假象？？？ M随GV增大而增 主动去M 被动去M 被动去甲基化依赖于DNA复制 DNA methlation and sperm remodeling 精子的去甲基化重编程 Passive demethylation occurs as a consequence of replication