化学 盐析沉淀法.ppt

* * 一、盐析沉淀法 盐析法： 在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白质（酶）等生物大分子物质。 （一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数的影响。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团 蛋白质呈稳定的分散状态 两性物质，一定pH下表面带有一定的 电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥 蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。 当向蛋白质溶液中加入中性盐时： 低盐--盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大) 高盐--盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小) 盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱 中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域 H+ OH- + + + + + + + + + + + pHpI,带正电，有水膜，是稳定的亲水胶体 _ _ _ _ _ _ _ _ _ pHpI,带负电，有水膜，是稳定的亲水胶体 _ + + + + + _ _ _ _ pH=pI时, 有水膜，是不稳定的亲水胶体 中性盐 破坏水膜 + + + + + + + + + + + 中性盐 破坏水膜 _ + + + + + _ _ _ _ 中性盐 破坏水膜 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中性盐 中和电荷 SO42- 中性盐 中和电荷 NH4+ 或Na+ 蛋白质的盐析机制示意图 蛋白质沉淀 蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。 1 2 3 4 5 6 1.0 2.5 2.0 0.5 -0.5 -1.0 -1.5 0 1.5 碳氧血红蛋白的lgS与(NH4)2SO4离子强度μ的关系 S0 β μ(离子强度) lgS 盐析 盐溶 盐析区: lgS = β - Ks μ 蛋白质溶解度 常数 盐析常数 盐离子强度 蛋白质溶解度 起始蛋白浓度 （二）无机盐的选择 在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4, Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。 (NH4)2SO4原因 廉价 在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度 对大多数蛋白质的活力无损害 0 20 40 60 80 100 中性盐 温度（oC） (NH4)2SO4 Na2SO4 MgSO4 NaH2PO4 70.6 75.4 81.0 88.0 95.3 103 4.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2 -- 34.5 44.4 54.6 63.6 70.8 1.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101 常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水） 盐析效果：阴离子 阳离子 尤其以高价阴离子更为明显。 常见阴离子的盐析作用顺序： PO43- SO42- CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN 阳离子对盐析效果的影响： Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+ 无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产 (分批加入，充分搅拌) 加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产 (防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释) （三）影响盐析的各种因素 无机盐的加入量 蛋白质的浓度 温度 pH 操作方式 1.无机盐加入量的影响 1 2 3 4 5 6 1.0 2.5 2.0 0.5 -0.5 -1.0 -1.5 0 1.5 S0 β μ(离子强度) lgS 盐析 蛋白质溶解度 0 2 4 6 8 10 -0.50 0.50 -1.00 μ(离子强度) lgS 蛋白质溶解度 0 不同蛋白质溶解度与离子强度的关系