第三章 免疫酶组织化学技术.ppt

第三章 免疫酶组织化学技术 免疫酶组织化学技术 酶------辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶…… 酶标记已知Ab(或Ag) + 组织细胞内相应的Ag(或Ab) 抗原抗体复合物(酶标) 底物 有色沉淀 定位； 图像分析仪半定量 免疫组化方法 酶标抗体免疫组织化学 直接法 间接法 非酶标抗体免疫组织化学 酶桥法 PAP法、APAAP法 一、酶标抗体免疫组织化学染色法 （一）原理 直接法和间接法。 直接法--- 是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。 间接法---两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。 (注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。) 免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确定该抗原的性质、存在的部位和含量。 酶 + 底物====不溶性的色素 标记酶: 辣根过氧化物酶 (HRP) 碱性磷酸酶(ALP) 葡萄糖氧化酶(GOD) β-D-半乳糖苷酶…… 1 辣根过氧化物酶 HRP： 显色：产物棕褐色 HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DAB性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20℃贮存。 注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色 浓缩的DAB—按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值； 粉剂DAB----溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配---保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加H2O2 2 碱性磷酸酶 ALP： 显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。 3 GOD(葡萄糖氧化酶)： 以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。 呈色反应注意要点： ① 底物浓度： 应够高，保证最大反应速度; ② pH值： 满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供; ③ 温度： 室温即18℃-22℃，或37℃； ④ 时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制， 以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可终止反应。 （二）染色程序 1 直接法（冰冻切片） 1）新鲜组织切片,冷丙酮固定10min,干燥后,入PBS。 2）0.3％H2O2 -甲醇液处理30’,封闭内源性过氧化物酶; 3）0.0l mol／LPBS洗3次。 4) 5％-10％正常羊血清室温处理30min。 5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体, 37℃孵育60’或4℃过夜。 6) 0.0l mol／L PBS洗3次。 7) DAB／H2O2显色(新鲜配制)。 8) 0.01mol／LPBS洗3次。 9) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。 2 间接法 1) 石蜡切片脱蜡至水； 冰冻切片 室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂 2) 甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。 3) PBS漂洗 4) 0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育液,不冲洗. 5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。 5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4℃过夜,