第五章 凝胶过滤层析.ppt

第五章 凝胶过滤层析 第五章 凝胶过滤层析第一节 概 述 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography, GF或GFC）是20世纪50年代前后发展起来的一种按分子大小进行分离的纯化手段。 在众多分离计划中被广泛采用，不同的文献中采用了多种不同的称谓: 凝胶层析（gel chromatography） 排阻层析（exclusion chromatography） 分子筛层析（molecular sieving chromatography） 立体排阻层析（steric exclusion chromatography） 体积排阻层析（size exclusion chromatography, SEC） 第五章 凝胶过滤层析第一节 概 述 凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 一、凝胶过滤的概念 不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离. 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 凝胶过滤分离蛋白质 的过程 （1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状 每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来； 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 在生物大分子的分离中，决定该分子在层析时的保留时间长短即洗脱快慢的因素不仅仅是相对分子质量，分子形状的影响也很大。有着相同分子量，但是形状不同的分子，其保留时间不同。一般来说，分子量相同情况下，不对称程度增加会使分子更容易被阻挡在凝胶颗粒的网孔之外，导致保留时间变短。 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积（matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶颗粒固相所占据的体积， 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和： Vt=V0+Vi+Vg 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 ㈡ 洗脱体积和分配系数 洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积. 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理 所示层析图谱中，样品由三种组分组成。 组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入 凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于