研究生专业技能训练 唐雪.ppt

举例 内参选定，共同扩增 －原理： PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 控 PCR整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析 Ct值 2.Real-Time PCR（实时定量） －用途： 组织的基因表达分析，应用非常广泛 －优点： 灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化 程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 Cycle 1 Cycle 3 Cycle 2 SYBR green ① SYBR green 作用原理 Molecular Probe公司的一个专利产品，US Patent 5,436,134 , 1993年7月12日申请 SYBR green 的优缺点 简便 可以使用已有的引物 普遍通用 可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体 需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增 价格 $1 / PCR 反应 定量的灵敏度有所欠缺 ② TaqMan体系 ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列) US Patent 5,723,591, 1995年11月申请。 实时检测: 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质 TaqMan系统的一个例子 10ng 0.001ng Titrate a template; 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng Taqman的优缺点 单一荧光系统中 不能在同一管中进行多片断扩增 不同的基因必须在不同的试管中 管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和可靠 灵敏度高，定量方便 费用高 多种荧光提供仪器价格比较贵 /pcr.html /molbio/ /genetics/ward/tavi/PCR.html http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/additives.html PCR的网上资源 核酸共轭双键 260 吸收峰 * 70C 打开RNA二级结构 95 灭酶 * 基线期 指数期 线性扩增期 平台期 * * HERE IS ANOTHER EXAMPLE SHOWING UNIFORM SPACING OF A SERIAL DILUTION, ROBUSTNESS IN REPLICATES, AND RANGE OF ASSAY Your company slogan LOGO RNA 提取及PT-PCR技术 研究生分子生物学实验 唐 雪 食品营养与功能因子研究中心 D117 TelE-mail:xuertang@163.com 基因表达(Gene Expression) 细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。 对这个过程的调节即为基因表达调控(Regulation of Gene Expression or Gene Control)。① 转录水平上的调控；② mRNA加工、成熟水平上的调控；③ 翻译水平上的调控  Gene (DNA) Transcription mRNA Protein Cellular Function Translation mRNA 每一个真核细胞约含5-10μg RNA 80-85%是rRNA（主要是28S、18S和5SrRNA） 10-15%tRNA和核内小分子RNA 1-5%的mRNA 分子量不均一 3′末端有polyA组成的尾，利用寡聚（dT）亲和层析柱分离 提取高纯度完整的RNA，是研究基因表达、体外转录、构建cDNA文库、 RT-PCR、Northern杂交的重要基础环节 实验安排 第一次课（全天） 实验一 小鼠肝脏总RNA提取（上午） 实验二 PCR技术扩增特异性DNA片段（一）（下午） 第二次课 实验二 PCR技术扩增特异性DNA片段（二） 实验一 小鼠总RNA提取 TRIzol法 TRIzol中含有RNase抑制剂（异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠） 增强核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白分离 在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无蛋白和DNA的水相中，容易被异丙醇沉淀 异丙醇使RNA沉淀浓缩 注意事项 实验成败的关键：严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性 全部实验过程中均需戴手套（使用一次性手套）、口罩操作 所用的玻璃器皿、塑料容器等均需进行处理后方可使用（详见注意事项） 实验所用试剂可用含有0.1% DEPC 121℃高