细胞融合与单抗技术.ppt

（二）杂种细胞的筛选原理及筛选系统 同型双核细胞 同型多核细胞 未融合的亲本细胞 异型多核细胞：　　　　 异型双核细胞：　　　　 目的细胞 筛选原理：将融合混合物接种于选择性培养基上， 终止同型多核、异型多核、及未融合的 亲本细胞的繁殖，而仅允许异型双核细 胞繁殖。 HAT选择培养基：含H（次黄嘌呤）、A（氨基喋呤）、 T (胸腺嘧啶核苷）的一种选择培养基。 筛选系统和方法： HAT选择培养基 1、全合成途径：利用糖和氨基酸等外源营养经体内代谢 　合成DNA的途径称全合成途径 正常动物细胞DNA合成途径： 糖和氨基酸 核苷酸 A （二氢还原酶的抑制剂） DNA 结果：全合成途径被终止。 HGPRT+：具次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，缺失则不能 进行嘌呤的合成． TK+：胸腺嘧啶核苷激酶，缺失则不能进行嘧啶的合 成． DNA 核苷酸及其前体 T dTMP TK HGPRT H HMP 核苷酸 2、补救合成途径：细胞从培养基或自身代谢产物中 吸收游离嘌呤和嘧啶合成DNA的 途径称补救合成途径 死亡 存活 死亡 亲本2（HGPRT+,TK+） 亲本1 （HGPRT-/ TK-） HAT PEG 融合体 HAT HAT （长寿命的瘤细胞） （短命的B细胞） 单克隆抗体:是由单一B细胞和杂交瘤细胞融合后的克隆株细胞产生的,只针对一种抗原决定簇的单一抗体. １．细胞培养材料的准备: ２．免疫动物 ３．亲本细胞的准备 ４．细胞融合 ５．融合细胞的筛选与克隆 单克隆抗体的大量制备 有限稀释法接种瘤细胞，２０％胎牛血清，常规培养． 优质血清能支持接种量≤２０个细胞／孔的细胞生长． 防止污染、筛选血清． 动物选择：选择与瘤细胞供体同品系的动物 抗原 颗粒性抗原：免疫原性强，免疫时 　不加佐剂 可溶性抗原：免疫原性弱，免疫时 　需加佐剂提高免疫效果 半抗原：无免疫原性，需与载体 　　结合后，才能免疫． 凡能固定抗原，并使之缓慢释放的惰 　性、无毒的物质．（膜体，珠体） 免疫途径：腹腔、皮下淋巴样器官、静脉 免疫佐剂:是能增强抗原免疫原性,或改变免疫 反应类型的物质(如:完全弗氏佐剂) 骨髓瘤细胞的选择: 本身不分泌任何抗体（筛选缺陷细胞株） HGPRT-或TK- 8-Az（杂氮鸟嘌呤）6-TG（巯基嘌呤） 筛选 Br-脱氧嘧啶核苷筛选 脾细胞分离： 放血处死动物 取脾脏，注射无血清培养液，挤压释放淋巴细胞 富集特异性B细胞 小鼠骨髓瘤细胞：冻存瘤细胞的复苏． 骨髓瘤细胞：脾细胞＝１－２：１０ 步骤： 离心沉淀细胞 缓慢加入PEG1ml，不断转动试管 １５ml无血清培养液（慢） 20%血清常规过夜培养 HAT筛选 洗涤 96孔板筛选杂交瘤细胞 培养约3d，未融合细胞开始死亡（胞浆出现颗粒细胞开始破裂），每3d换液一次。第10-14d，以HT培养液逐渐代替HAT，进行半量换液。 当细胞集落长到1/5-1/3孔时，收集上清夜进行特异性抗体检测。 HAT培养液（每孔100ul） 对照：未融合的骨髓瘤细胞 筛选杂交瘤的方法：第二抗体法 一抗：与目的抗原专一性结合，多为IgG型。 二抗：抗IgG抗体 IgG特异位点 标记酶 解决方法： 融合细胞进行克隆：有限稀释法，软琼脂法 杂交瘤染色体鉴定 多次重复筛选。 问题： 每个融合培养孔可能有针对不同抗原决定簇的多个克隆存在。 杂交瘤不稳定。 结果： 连续3次特异性抗体检测阳性率为100%。 体外培养：对数生长期杂交瘤细胞悬浮 于５％血清培养基中，常规培 养２ －３d,补充２．５％血清 培养基， 继续培养２d,离心收 集上清． 体内培养：腹腔注射对数生长期杂交瘤细胞，诱生腹水，１－２周后取腹水． 治疗用抗体发展的三个阶段 单克隆抗体 基因工程抗体 多克隆抗血清 鼠源性引起免疫排斥 人源性单抗制备的困难 1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（ ） 　 A.经过免疫的B淋巴细胞 B.没经过免疫的T淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞 D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞 A 2. 单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是------（ ） A.由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合 B.由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成