6—羟基多巴胺损伤早期帕金森病大鼠模型实验探究.doc

6—羟基多巴胺损伤早期帕金森病大鼠模型实验探究 　　摘要：目的 观察6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine， 6-OHDA）损伤早期帕金森病（Parkinson’s disease， PD）大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点。方法 偏侧前脑内侧束注射6-OHDA，通过阿扑吗啡诱发旋转试验、跨步调节试验和姿势部对称试验评估注射后24 h、7 d及28 d大鼠行为学的变化；通过免疫组织化学染色观察黑质部位酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）阳性细胞计数的变化。结果 6-OHDA组大鼠跨步调节试验评分减少，姿势不对称试验评分增加，阿扑吗啡诱发大鼠向损伤对侧旋转，与对照组和假手术组比较统计学差异显著（P210次/30 min为合格模型。 1.2.4组织学检测 1.2.4.1动物灌注、固定、取材、切片 各组大鼠在最后一次行为学检测后，用复合麻醉剂麻醉，剪开大鼠胸腔，经主动脉快速灌注生理盐水（37℃）150～200 mL冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再缓慢灌注300 mL，至头与四肢均已发硬。断头取脑，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸盐缓冲液内，存4℃冰箱至脑块沉入瓶底。取中脑黑质组织块进行冠状连续冰冻切片，片厚20 μm。 1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具体步骤依次为：冰冻切片用0.01 M（pH7.4）磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）复性（2 min），非免疫的正常羊血清，室温下孵育30 min，抗TH抗体（1∶1000，抗体稀释液稀释），37℃孵育4 h， SABC试剂，室温下孵育1 h， DAB显色（阳性产物为棕黄色）。以上各步骤之间均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清与抗TH抗体孵育之间不漂洗。显色后贴片，自然风干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 　　1.2.4.3 TH阳性神经元记数 各组大鼠取包含黑质致密部最明显的中脑切片，在×100倍显微镜下计数两侧黑质有完整细胞体的TH阳性细胞，计算左侧与右侧黑质TH阳性细胞数的百分比（左侧黑质TH阳性细胞数/右侧黑质TH阳性细胞数×100% ）。参照蔡文琴等[5]介绍的神经细胞计数方法进行细胞计数。 1.2.5统计学分析 数据结果均使用 SPSS13.0软件进行统计学分析。数据资料采用均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析进行差异性检验，P210次/30 min，对照组及假手术组大鼠未诱发出旋转行为，见表3。 2.2组织学检测 抗TH染色结果显示，在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，大鼠左侧黑质TH阳性神经元数目出现有意义减少，高倍镜下见少部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等变性征象，部分神经轴突断裂、错乱；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元几乎消失，残留的TH神经元表现出染色质浓缩坏死现象，神经轴突散在稀疏；模型组大鼠右侧黑质TH阳性神经元数目同时也有部分减少；对照组及假手术组大鼠两侧黑质TH阳性神经元无明显改变，见表4，图1。 3讨论 研究PD需要建立稳定可靠的模型。6-OHDA是一种选择性中枢儿茶酚胺能神经元毒性物质，具有很强的呼吸链抑制作用，偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先报道了应用6-OHDA成功制备大鼠偏侧PD模型，这种模型能够在多巴胺能药物的诱发下产生旋转行为，以便于判断模型成功与否。阿扑吗啡是多巴胺（dopamine，DA）受体激动剂，能够引起该模型向健侧旋转，这是由于损伤侧纹状体多巴胺含量下降，多巴胺D2受体代偿性大量增加，且敏感性增高，出现超敏现象[7]，此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。 PD的神经保护治疗需要早期进行，评估6-OHDA损伤早期大鼠行为学变化，可进一步明确模型是否成功及神经保护性治疗是否有效。阿扑吗啡诱发旋转试验结合非药物诱发的行为学试验，其评估结果更加有效、可靠[8]。在偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后数小时，大鼠出现肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧不自主旋转，不能进行直线或随意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步调节试验和姿势不对称试验出现有意义改变，腹腔注射阿扑吗啡后可诱导大鼠在原地向健侧旋转，以健侧后肢为支点，首尾相接，形成环状，但旋转次数210次/30 min，符合成功PD模型标准；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元减少90%。偏侧前脑内侧束注