RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型建立.doc

RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型建立 　　[摘要] 目的 利用shRNA表达载体建立FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型。方法 将化学方法合成的特异性FRAT1基因siRNA，以人类结肠癌HT29细胞为实验对象，采用Lipofectamine将FRAT1基因的shRNA表达载体导入细胞后，用RT-PCR和Western blot检测目标基因FRAT1的表达水平。结果 稳定转染FRAT1 shRNA表达载体（pSINsi-FRAT1）后，FRAT1基因在mRNA和蛋白质表达水平分别下降92.63%、55.72%（P 　　1.2.4 HT29细胞总RNA 抽提及RT-PCR 总RNA抽提按Trizol产品说明书进行。操作步骤如下：用PBS清洗两遍收集的细胞，RNA Trizol裂解，氯仿抽提，异丙醇、75%乙醇沉淀、洗涤后，溶解于DEPC水中，测定RNA浓度。利用提取的RNA进行RT-PCR，获得cDNA。RT-PCR按宝生物工程公司的试剂盒说明操作。RT条件为：42℃ 90 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。 1.2.5 PCR 取cDNA作为模板扩增FRAT1和GAPDH，其中扩增FRAT1特异性引物为：sense primer：5′-GCCCTGTCTAAAGTGTATTTTCAG-3′，antisense primer：5′-CTCTGCAGTCCTACTCAAGCG-3′。扩增片段长325 bp。扩增GAPDH作为内参对照，引物序列分别是sense primer：5′-TCACCATCTTCCA GGAGCGAG-3′，antisense primer：5′-TGCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′。扩增产物长615 bp。PCR条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 25 s，72℃ 7 min，4℃ 5 min，30个循环。相关产物在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。 1.2.6 转染细胞总蛋白的提取及Western blot鉴定 收集细胞后用预冷PBS清洗两遍，加入含PMSF的裂解液（1 ml含1 μl PMSF）200 μl，于冰上裂15 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清。蛋白浓度用BCA法测定，取上清12 μl，与3 μl 5×loading buffer混匀，100℃煮沸5 min，所得样品经SDS电泳120 V 25 mA 150 min分离后，冰上电转至PVDF膜50 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，按顺序加入兔抗人FRAT1基因抗体（4℃过夜，次日TBS-T Buffer洗6次，5 min/次），H暗室曝光，显影，定影。底片在UVP凝胶成像系统下成像、保存。 1.3 数据分析 将PCR及蛋白印迹操作最后得到的胶片进行拍照扫描，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro Analyzer）进行分析。分别计算FRAT1各条带与内参GAPDH条带的相对光密度比值。重复3次实验。HT29细胞中FRAT1基因的含量设为1，转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞FRAT1基因下降率求3次平均值，得出FRAT基因表达的下降率。选用统计软件SPSS 13.0，采用两组独立样本的t检验分别分析3组转染组细胞中蛋白和mRNA的光密度与内参GAPDH光密度比值与空白对照组蛋白和mRNA与内参光密度比值，检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 重组shRNA表达载体的鉴定 提取重组shRNA表达载体DNA进行测序鉴定，结果表明表达shRNA的DNA模板链已成功插入载体的正确位置（委托大连宝生物进行测序）。针对FRAT1基因的重组shRNA载体命名为pSINsi-hu6-FRAT1，而无功能shRNA载体命名为pSINsi-hu6-control（图1）。 图1 重组质粒电泳 A.CTF182-1-1；B.CTF182-N-1；C.CTF182pSINsi-hu6 2.2 阳性克隆的筛选 利用Lipofectamine 2000转染载体24 h后，对未转染对照孔，转染无功能shRNA对照孔，转染空质粒pSINsi-hu6对照孔及转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体孔进行G418筛选。经G418（600 μg/ml）筛选培养，第2天细胞开始死亡，到了第5天未转染对照孔细胞全部死亡。HT29细胞转染无功能shRNA、转染pSINsi-hu6载体及转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞10～14 d后，出现G418抗性克隆，然后降低G418浓度（300 μg/ml）继续培养2个月，细胞保持稳定增殖直至出现明显克隆形成。挑取单克隆从96孔-24孔-6孔-克氏