基因工程原理（DNA 与 RNA）.ppt

重组体的筛选与鉴定 抗药性记号插入失活筛选 β-半乳糖苷酶显色反应筛选 菌落或噬菌斑杂交筛选 表达载体产物的免疫化学检测法 利用营养缺陷型进行筛选 Bacterial colonies containingcloned segments of foreign DNA Radioactive DNA Transfercells tofilter 1 Solutioncontainingprobe Treat cellson filter toseparateDNA strands 2 Add probeto filter 3 ProbeDNA Gene ofinterest Hydrogen-bonding Autoradiography 4 Developed film Colonies of livingcells containinggene of interest Compare autoradiographwith master plate 5 Master plate Filterpaper 重组体的筛选与鉴定 抗药性记号插入失活筛选 β-半乳糖苷酶显色反应筛选 菌落或噬菌斑杂交筛选 表达载体产物的免疫化学检测法 利用营养缺陷型进行筛选 目的蛋白表达形式 细胞内表达 细胞外表达 诱导表达 组成型表达 定位表达 非定位表达 基因工程原理（DNA 与 RNA） DNA 与 RNA 基因 指能产生一条肽链的DNA片段。包括编码区和其上下游区域（引导区和尾部），以及在编码片段间（外显子）的割裂序列（内含子） 5’ 3’ 原核生物基因结构 RNA 转录子 蛋白编码区 终止子序列 启动子/调控 区域 3’非翻译区 转录起始位点 5’ 非翻译区 真核生物基因结构 β-珠蛋白基因为例 β-珠蛋白基因 外显子 内含子 真核生物与原核生物基因表达 基因工程定义 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒、或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。 工具酶 限制性内切酶 修饰酶 限制性内切酶的分类与命名 细菌的限制与修饰系统 分类 Ⅰ型限制性内切酶 Ⅱ型限制性内切酶 Ⅲ型限制性内切酶 命名 第一个字母是属名的第一个字母（大写），后两个字母是种名前两个字母（小写），有时也包含菌株名称，第一次分离到的内切酶为Ⅰ，其次为Ⅱ等。例如：HindIII Haemophilus influenzae Rd. 限制性内切酶与黏末端 5’ overhang 5’ overhang 5’ overhang 3’ overhang blunt end 修饰酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸酶 激酶 核酸酶 连接酶 载体 用途 1、克隆载体 2、表达载体 来源 1、质粒 2、噬菌体 3、黏粒载体 4、病毒 5、细菌人工染色体 6、酵母人工染色体 载体应具备的条件 能自我复制 具有选择标记 具有多克隆位点 质粒 质粒载体 目的基因的获取 人工合成 基因组文库 cDNA文库 PCR EcoR I Partial digestion 基因组文库 Infect cells 基因组DNA cDNA文库 mRNA cDNA 双链cDNA 克隆到载体中 转化细菌 逆转录酶 DNA聚合酶 基因组文库 cDNA文库 PCR 一对引物 扩增模板 dNTP 耐高温DNA聚合酶 PCR循环 高温变性 低温退火 中温延伸 PCR 重组DNA分子的构建 重组DNA分子导入受体细胞 转化 转染 电穿孔 基因枪 显微注射 根癌农杆菌介导（T-载体） 脂质体载体法 重组体的筛选与鉴定 抗药性记号插入失活筛选 β-半乳糖苷酶显色反应筛选 菌落或噬菌斑杂交筛选 表达载体产物的免疫化学检测法 利用营养缺陷型进行筛选 重组体的筛选与鉴定 抗药性记号插入失活筛选 β-半乳糖苷酶显色反应筛选 菌落或噬菌斑杂交筛选 表达载体产物的免疫化学检测法 利用营养缺陷型进行筛选 MCS X-gal