免疫诊断与防治.ppt

第七章 免疫诊断与防治 王 慧 2、沉淀反应 (1)单向琼脂扩散 　　(2)双向琼脂扩散 单向免疫扩散 双向免疫扩散 在双扩基础上加电泳，Ag孔置负极端，Ab孔置正极端，Ag带负电荷多于Ab，向正极泳动，Ab由正极向负极泳动，形成对流，比例适宜处形成沉淀线，为对流电泳。 免疫标记技术 1.免疫荧光法（immunofluorescence，IF） 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA） 3.放射免疫测定法（radio immunoassay，RIA） 4.化学发光免疫分析 （chemiluminescence immunoassay，CLIA） 5 免疫印迹法 （immunoblotting, Western blot) 抗原抗体反应特异性 酶催化反应高效性 ELISA 双抗体夹心法(测Ag) 间接法(测Ab) 免疫印迹法 外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。 血液中PBMC的密度与其他成分不同： 血小板的密度为1.030～1.035， 粒细胞为1.092， 红细胞为1.093， 淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075～1.090。 利用一种密度介于1.075～1.092之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。 常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺分层液法和Ficol分层液法两种。 单核细胞的获得 1．粘附法 单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过PBMC与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的粘附细胞即为淋巴细胞。 淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。 E花结实验 T细胞表面CD2分子+绵羊血红细胞→玫瑰花结 尼龙棉柱分离法 将淋巴细胞悬液加入尼龙棉柱内，B细胞易粘附于尼龙棉纤维(聚酰胺纤维)表面，而T细胞则不易粘附，由此可将T细胞与B细胞分离。 该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，所获T细胞纯度可达90%以上，B细胞纯度可达80%。 免疫磁珠分离法 包括直接法和间接法。 直接法是将特异性抗体与磁性微粒(平均直径小于1.5μm)交联，形成免疫磁珠(IMB)。IMB与表达相应膜抗原的细胞结合，用强磁场分离磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞，从而对特定细胞进行阳性或阴性分选。 间接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体(第一抗体)的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。 淋巴细胞的功能检测 ?T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞活性测定 1、T细胞功能检测 T细胞增殖试验 细胞毒试验 皮肤试验 （一）T细胞增殖试验 T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞的代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，如细胞变大、胞质增多、胞质现空泡、核染色质疏松、核仁明显，并转化为淋巴母细胞。 淋巴细胞增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化。 常用刺激物 体外刺激T细胞增殖反应的刺激物包括 植物血凝素 (PHA) 刀豆素A(ConA) 美洲商陆(PWM) 白喉类毒素 破伤风类毒素 纯化蛋白衍生物(PPD) 白色念珠菌 检测T细胞增殖反应 1．形态学检查法 2．3H-TdR掺入法 3．MTT比色法 1．形态学检查法 分离PBMC，与适量PHA混合，置37℃培养72h。取培养细胞作涂片染色，借助光学显微镜进行检测。根据细胞的大小、核与胞质的比例、胞质的染色性以及有无核仁等特征(见图24-6)，分别计数未转化的淋巴细胞和转化的淋巴细胞，每份标本计数200个细胞，按公式计算淋巴细胞转化率。 转化率在一定程度上可反映细胞免疫功能，正常人的T细胞转化率为60%～80%，小于50%可视为降低。 形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。 2、B细胞功能检测 B细胞增殖试验 溶血空斑试验（抗体形成细胞测定） 酶联免疫斑点法 3、NK细胞活性测定 NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD59等多种抗原，但均非NK细胞所特有，现今