地高辛标记DNA探针对茶园NPV检测.docVIP

地高辛标记DNA探针对茶园NPV检测 　　摘要：研究合成了茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）的地高辛标记DNA探针，采用斑点杂交检测茶园几种核型多角体病毒。结果表明，以含EcobNPV克隆片段的大肠杆菌菌液为样品时，斑点杂交检测灵敏度为80 CFU/μL。以感染病毒致死的茶尺蠖幼虫为试材，提取病毒基因组DNA，采用斑点杂交法检测均得到强的杂交信号。斑点杂交检测可有效区分茶园中几种核型多角体病毒，表明地高辛标记DNA探针的特异性好。 关键词：茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）；地高辛标记DNA探针；斑点杂交；检测 中图分类号：Q93-331；S476+.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5894-04 茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）属鳞翅目尺蠖蛾科害虫，我国各茶区均有发生。以幼虫食叶为害，严重影响茶叶的产量，且易导致茶树早衰、耐寒力变差[1]。茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）于1977年在我国首次发现[2]，属杆状病毒科，核型多角体病毒属。EcobNPV是茶尺蠖的重要致病微生物，它通过幼虫取食后侵入虫体并迅速增殖，使其感染发病而死亡，并且对茶尺蠖幼虫感染力强，致死率高，对人、畜及天敌昆虫安全[3-7]，尤其是其可通过感病幼虫的排泄物或尸体等进行水平扩散，通过产卵进行垂直传递[8]，对茶尺蠖危害具有良好的持续控制效果。我国较早开展了EcobNPV的生物学及应用基础研究，现在该病毒制剂已获批农药登记许可，广泛应用于各种类型茶园。 目前，EcobNPV主要使用常规PCR技术进行定性检测，该方法存在操作过程易污染、单次检测样本少且假阳性高等缺点，而核酸斑点杂交技术因具有灵敏度高、结果观察直观和在单位膜上可完成多个样品的同时检测等优点，尤其是非放射性标记的发展，使该技术在病毒和类病毒的研究和检测中得到广泛应用[9]。同时核酸斑点杂交技术还可反映病毒株间在基因水平上亲缘关系的远近或异同。 为监测茶尺蠖核型多角体病毒在茶园的流行动态，并比较其与某些昆虫杆状病毒的同源性，本研究以EcobNPV为试验材料，探索了该病毒的核酸斑点杂交检测技术。 1 材料与方法 1.1 试验材料 EcobNPV湖北分离株由湖北省农业科学院果树茶叶研究所茶植保课题组提供。EcobNPV安徽分离株由中国农业科学院茶叶研究所提供。茶毛虫、茶刺蛾、茶小卷叶蛾、感染EcobNPV的茶尺蠖均为2011年在本所茶园收集。 1.2 试验试剂 dNTP购自Promega公司；Taq DNA聚合酶购自Takara公司；带正电的尼龙膜为Amersham Pharmacia Biotech公司产品；探针标记试剂盒和杂交检测试剂盒为New England Biolabs公司产品。 1.3 核酸杂交 1.3.1 病毒提纯 采用常规方法[10，11]进行病毒提纯。在供试的茶毛虫、茶刺蛾、茶小卷叶蛾、感染EcobNPV的茶尺蠖中加入PBS 缓冲液充分研磨后，4层纱布过滤，滤液4 ℃条件下500 r/min 离心5 min弃沉淀，上清液3 500 r/min离心30 min。用适量缓冲液继续悬浮沉淀，3 500 r/min 离心30 min。差速离心反复进行多次，直至多角体悬液呈乳白色状。 1.3.2 基因组DNA的提取 取适量纯化的多角体悬液加入等体积的新配制的碱裂解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaCl），37 ℃水浴30～60 min；加100 mg/mL SDS至终浓度为10 mg/mL，加蛋白酶K至终浓度为200 μg/mL，37 ℃水浴1 h；加入等体积水饱和酚∶氯仿（体积比25∶24），振荡混匀，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min；取上清液加入等体积的氯仿，振荡混匀，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，重复此步骤1次；取上清液加入0.1倍体积的3 mol/L 醋酸钠（pH 5.4）和2.5倍体积无水乙醇，-20 ℃沉淀20 min 后12 000 r/min离心15 min，弃上清液，用70%乙醇洗涤2次，于超净台上吹干，用适量水或TE溶解，4 ℃保存备用[12-14]。 1.3.3 目的片段PCR扩增 根据EcobNPV基因组序列（NC_008586.1）设计了1对特异性引物，由上海生工生物技术服