第六章荧光法.ppt

第六章 分子发光分析 第一节 概述 第二节 原理 第三节 仪器 第四节 特点及应用 荧光蛋白质 在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁?沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术。 用绿色荧光蛋白标记的细胞 用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体(细胞、细胞器)的标记。 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。 荧光染料 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。 用于增白洗衣粉中的增白剂， 指示信号用的各种荧光路标漆， 荧光标志服等。 荧光增白剂 它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果。 其作用是把制品吸收的不可见的紫外线辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有的黄光辐射互为补色成为白光，提高产品在日光下的白度。 当物质被辐射能照射后，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，处在高能级不稳定状态的分子，必须释放多余能量，变成稳定状态的分子。 在由激发态能级回到基态能级的过程中以光的形式释放多余的能量，并发射出比原波长更长的光谱，称为分子发光。 检测分子发射光谱的分析方法为荧光分光光度法。 第二节 原理 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。 大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。 1.3 激发态→基态的能量传递途径 非辐射能量传递过程 系间窜越：不同多重态的两个电子能级之间的非辐射跃迁。 S1 T1 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中 。 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 2. 分子荧光的类型 分子因吸收光能而被激发，所产生的次级光发射现象称为光致发光； 分子被激发的能量是由化学反应释放的能量所提供，其发光现象称为化学发光。 荧光棒 荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物和荧光染料三种化学成分构成。荧光棒发光原理是过氧化物和酯类化合物发生反应后，能量传递至荧光染料，再由染料发出荧光。 属于化学发光。 发光机制是两种物质——荧光素和荧光素酶——合作产生的结果 3.激发光谱与荧光(磷光)光谱 3.2 荧光光谱(或磷光光谱) 三、荧光物质 2. 荧光与分子结构的关系 （1）共轭效应 ? →?* 跃迁 芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大. 3,4-苯并芘 刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。 （3）取代基的影响 给电子基增强荧光： －OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N 吸电子基减弱荧光： －COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光: 3.荧光物质的分类 自荧光物质（内源） 间接荧光物质（外源） 第三节 荧光分光光度计 测光角度不同 单色器位置不同 比色皿不同 第四节 特点及应用一、特点 灵敏度高，检测限比吸收光谱法低2~4个数量级； 选择性比吸收光谱法好，因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光； 试样用量少和方法简便； 能提供较多的物理参数； 应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 二、应用 无机物通过与荧光试剂作用生成荧光螯合物而进行荧光分析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多， 荧光试剂一般是具有两个（或以上）与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。 例如，测定Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等 用于测定无机离子的荧光试剂 生物化学分析，生理医学研究，临床检测. 直接测定能产生荧光的物质. 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸. 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质. 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构； 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光； 无机离子可同荧光试剂形成荧光络合物。 举例— 痕量3,4-苯并芘的测定: 荧光笔是近几年新出的做记号用的笔用较粗、较淡的墨水覆盖关键部位来做记号,做上记号后,不遮挡住文字一目了然。荧光