2009-2010学年研究生植物化学课程译文胡维岗译combinatorial.docVIP

Combinatorial biosynthesis of plant medicinal polyketides by microorganisms 化学生物学新见 Current Opinion in Chemical Biology 2009, 13:197–204 微生物组合生物合成多酮类植物药物 堀之内 末治 （日本，东京113-8657，东京都文京区，东京大学，农业生命科学研究院，生物工程系） 化学生物学专业 2009级 胡维岗 翻译 摘要 组合生物合成是这样一种办法，将从不同生物体获得的基因组合设计，同时构建人造基因簇来生产生物活性化合物。人们已经设计和表达了一个能够进行人工生物合成多酮类植物药物，如类黄酮，芪类，异黄酮和姜黄素的大肠杆菌系统。以酪氨酸和苯丙氨酸启始底物，这个系统能合成诸如柚皮素，白藜芦醇，染料木素和姜黄素等物质。以人造羧酸作为前体可诱导大肠杆菌细胞生产非天然化合物。此外人工改良酶可以生产天然和非天然的黄酮醇，黄酮和甲基化白藜芦醇。这种微生物系统不但可以通过纳入其他聚酮类合成途径和各种来源的修饰酶，作为人工合成途径的一种方法，构建一个较大产物库，而且可以有效利用大量具有潜在利用价值的宿主微生物。 引言 组合生物合成技术是生产新的天然产物和稀有昂贵天然产物的一种新方法。I型聚酮合成酶（PKSs）和核糖体肽合成酶（NRPSs）组成的酶系统运作就像一条流水线，已成功应用于组合生物合成新的，复杂的化合物。由于分子生物学技术和生物信息学预测单一基因的产品技术的快速发展，不同生物基因组资料的爆炸式积累，构建一个庞大的基因组数据库已成为可能，这个数据库助于结合代谢途径和人工设计生物合成途径在不同生物体内尤其是在微生物内生产目标化合物。我们第一个成功利用人工组装苯丙氨酸途径，在大肠杆菌中发酵生产特异植物药物多酮的例子，标志着一个完整的用氨基酸前体、苯丙氨酸和酪氨酸生产的黄烷酮的植物生物合成途径在异源微生物中成功建立了。这种结合来自不同生物基因和基因组来设计生产生物活性化合物的方法，不仅有利于化学产物和天然产物库的多样化，而且也能有效利用宿主的潜力,特别是微生物宿主。还应指出的是，我们的方法是产生的复杂的化合物源于微生物发酵的初级代谢产物，与由不同的方法生产的中间化合物截然不同。其最近的一个例子是在大肠杆菌中生产5-脱氧黄烷酮，自然树莓酮和花青素。 在植物苯丙氨酸途径中，为生产植物多酚类物质，提供中间前体黄烷酮和查尔酮合成酶（CHS）是关键的一步（图1）。这个途径还需要4 -香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）。在研究链霉菌次生代谢的一个因子调控因子时，我们不但在微生物中首次发现PKS III家族的RppA，而且发现了肉桂酸：CoA连接酶。一发现这两种酶，随后又被认为是植物中特有的酶，我产生了一个将这些酶基因作为人工合成途径的成员在细菌中生产植物多酚的想法。在这里，本人认为通过人工合成途径的组装和表达，在大肠杆菌中能生产天然和非天然类黄酮(C6-C3-C6), 芪类(C6-C2-C6)，以及姜黄素(C6-C7-C6)。 1 人工合成途径在大肠杆菌中发酵生产植物聚酮类化合物 1.1 微生物生产聚酮类植物药的概念和战略 我们生产特定的植物聚酮的策略是，在微生物装配源自不同生物体的各种酶基因，在大肠杆菌中设计一条人工苯丙氨酸途径，同时为了产物库的多样化，并进一步向该途径中添加一些修饰过的酶基因。为了合成黄烷酮药物，我们根据植物合成途径，将从酵母深红获得的苯丙氨酸裂解酶(PAL)，从放线菌霉菌?3（2）中获得的4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL 或 ScCCL)和从甘草植物中提取的查尔酮合成酶(CHS)组装在一起表达，为了合成芪类药物，我们将从花生组织中提取的二苯乙烯合成酶（STS）和从植物葛根质粒单性能鉴定试验中获得的苦瓜几丁质酶(CHI)组装在一起表达（图2）。在各种人工基因簇系统中，我们测试了各种优化的表达系统，结果表明含有T7启动子（IPTG诱导）和含有四个前端结合（质粒pET - PT7 - 4GS）序列的核糖体合成基因的recA宿主是最佳的表达系统。此外，在这个人工合成途径中，当从谷氨酸棒状杆菌发现的乙酰辅酶A羧化酶的两个亚基的基因（dtsR1和accBC）在不同于pET菌的pRSF-ACC质粒表达载体上同时表达时，黄酮产量大幅度增加，这大概是因为乙酰辅酶A羧化酶基因的表达，大大增加了细胞内的丙二酸辅酶A 含量的原因。 1.2 黄烷酮和芪的生产 能使重组大肠杆菌细胞高产黄酮类化合物，并使产生的黄酮易纯化，来自大肠杆菌宿主细胞的污染小的发酵生产条件已经确定。当浓缩细胞（50克湿细胞/升）在含有抑制质粒表达的抗生素和诱导的T7号启动子的IPTG的M9培养基中培养时，没有观察到细胞的增长，只发现葡萄糖的