薄层扫描法(TLCS).ppt

三、使用中应注意的问题 正确选择测量波长与参比波长 在正确的位置用正确的波长设置零点 设置正确的扫描范围 用程序扫描时精确测量斑点的间隔 保证足够的扫描长度 * 薄层扫描法 一、.双波长薄层色谱扫描仪 1 光学系统 主要包括光源(氘灯与钨订)、单色器(入口狭缝．出口狭缝、光栅等)．以及检测器(监测光电倍增管、反射和透射测定光电倍增管)组成。 2 主要功能 (1)可进行物质的紫外-可见原位吸收光谱测绘 紫外-可见吸收光谱既可作为物质定但的参考，又可提供待测物质的最大吸收波长，以便进行色谱测定。 仪器在记录吸收光谱时，可提供两种方式。一种为标准方式(NORMAL)，这种方式记录光谱进行波长扫描时，所测得光谱数据，一方面存入文件中，同时也输出到记录器上。另一种方式为差示方式(DIFFERENCE)．它可将测得光谱数据减去文件中存贮的光谱数据，并将其差值只输入到记录器中，而不存贮在文件里。 要想得到校正过基线的正确光谱，应这样进行：先以标准方式，在巳展开过的荡层板上无斑点的空白位置上，进行一次波长扫描，将基线光谱(它反映空白板对各种技长光的吸收情况)存入文件中(亦可输出到记录器去)。然后再用差示方式对待测斑点进扣波长扫描，就能得到扣除薄层空白板吸收的待测物质的正确光谱图。 (2) 多通道自动扫描 仪器提供的程序方式(PROGRAM)，可完成冬通道的自动扫描。程序方式中有七种参数供使用。它们包括波长1和波长2，用来分别设定测量波长和参比波长，可以进行双波长扫描。 薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。 1. 薄层吸收扫描法的基本原理 薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展开压离(L)的变化，而获得A—L成A—Rf曲线，即薄层色谱扫描图(简称扫描图)。 曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律，需田Kubelka—Munk(古柏尔卡—曼克)理论来描述。该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。 二、基本原理与方法 1.1 Kubelka—Munk理论 Kubelka—Munk理论说明了固定相的散射参数对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响。该理论的基本方程式如下。 （1）薄层色谱斑点的透射率： 上式是Kubelka—Munk理论描述薄层色谱斑点透光率的最基本公式。式中Sx是薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度、薄层厚度及涂布均匀程度有关。其数值大小直接影响薄层色谱斑点的吸光度—浓度曲线偏离Beer定律的情况。只有已知薄层板准确的SX值，才能正确地运用曲线校直法进行薄层扫描定量分析。薄层色谱斑点中物质的含量包含于a及b两个参数中。 式中的X为薄层厚度， SX含义同前，K为单位薄层厚度的吸光系数。K虽称为“吸光系数”是因“单位厚度”而得名，它与分光光度法中物质的吸收系数不向，与薄层色谱斑点中物质的浓度有关。KX称为吸收参数，相当于薄层色谱斑点单位面积中物质的含量(ug／cm2)。 （2）薄层色谱斑点的反射率(R) (3)薄层色谱斑点的吸光度(A) 理想的空白薄层板(简称空白板)的单位薄层厚度的吸光系数K＝0。事实上，一般空白板K≠0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。 (a)在透射法中薄层色谱斑点的吸光度： 上式中i及i0分别为透过斑点及空白板的透射光光强，I0为照射光光强。T与T0分别为斑点及空白板的透射率。 反射法示意图 (2)在反射法中薄层色谱斑点的吸收度A： 1.2 Kubelka—Munk曲线 Kubetka—Munk曲线是以薄层固定相不吸收照射光，即空白板的K＝0为前提，按照空白板的散射参数，用KubeIka—Munk理论有关方程式算出斑点的A—KX理论曲线。由于薄层固定相颗粒的散射作用，对于透射法及反射法造成偏离Beer定律的影响正好相反，故需按两种情况讨论。 （1）透射法的Kubelka—Munk曲线 （2）反射法的Kubelka—Munk曲线 对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还可发现后图比前图的横座标大25倍，这说明了反射法的灵敏度(响应值)比透过法小。 1.3 Kubelka