HA蛋白多肽抗体的设计、制备与鉴定.pdf

第 34卷 第 l2期 家畜生态学报 Vo1．34No．12 2013年 12月 ActaEcologiaeAnimalisDomastici Dec．2013 HA蛋 白多肽抗体的设计、制备与鉴定 袁红花 ，王珍珍 ，陈仁金 ，胡安康 ，张腾业 ，吴连连 ，冀德君 ，朱孝荣 (1．徐州医学院，江苏 徐州 221004；2．扬州大学，江苏 扬州 225009) [摘 要] 利用人工合成的多肽制备 HA的特异性多克隆抗体 ，以期用于 HA基 因的免疫调 控机制研 究。根据GenBank中报道的皮蝇素A(HyderminA，HA)一级结构信息以及 HA抗 原生物学信息，获得三段序列特异性较高的多肽，采用9一氟甲氧羰基固相合成法获得多肽， 采用 HPLC和 LC ·MS测定合成 多肽的浓度和分子量，试验表 明 目的多肽纯度达 91．2 、目 的多肽分子量为28kD。将 多肽与KLH进行偶联 ，并用其免疫新西兰大 白兔以获得抗血清和 多克隆抗体 。采用 ELISA 和 Westernblotting测定其效价和特异性，经 ELISA检测表 明抗 血清可与 Pep发生特异性免疫反应，经 Westernblotting试验表 明抗血清和 多克隆抗体可识 别 HA特异性条带，其相对分子量为28kD，与预测分子量相符。该抗体的制备为研究HA免 疫调控机制提供 了有用工具。 [关键词] HA ；序列分析 ；多肽 ；多克隆抗体 [中图分类号] $811．6 [文献标识码] A [文章编号] 1005—5228(2013)012—0018—04 牛皮蝇蛆病是由牛皮蝇寄生于牦牛或黄牛体 内 段 ，采用 固相多肽合成法合成多肽 ，免疫家兔 ，制备 引起的一种家畜寄生虫病 ，牛只感染后可使产奶量和 HA的多克隆抗体。为进一步研究 HA 的分子功能 产肉量降低 ，牛皮穿孑L，给养牛业带来巨大的经济损 提供 了有用的工具 。 失。研究发现 ，纹皮蝇和牛皮蝇幼虫能在宿主组织 中 1 材料与方法 移行 8个月，其分泌的四种丝氨酸蛋 白酶一皮蝇素 ， 起免疫抑制作用，以致宿主不能用免疫机能杀死蝇的 1．1 试验材料 幼虫。皮蝇素A(HyderminA，HA)是牛皮蝇一期幼 新西兰大 白兔为徐州医学院实验动物 中心饲 虫在宿主体 内游行时分泌的一种丝氨酸蛋 白酶。皮 养 ；完全弗氏佐剂和不完全弗 氏佐剂购 自购 自Gib— 蝇素 A具有抗炎、抑制补体反应等功能[1-2~。 COBRL公司；载体蛋 白交联试剂盒购 自Pharmacia 据研究报道 ，HA调节宿主免疫功能有下列 3 Biotech公司 ；ECL化学发光试剂及 BcA蛋 白定量 种机制 ：HA抑制 IL一1O生成 ，从而抑制 T一淋 巴细 试剂盒购 自Pierce公司；HRP—IgG抗体购 自Santa 胞增殖_3；裂解补体 C3，中断宿主补体反应途径E； Cruz公司。 HA通过前列腺素途径 ，过表达前列腺素 E2，减少 1．2 方 法 IL一2生成 ，抑制免疫排斥_l5]。HA这些免疫调节功 1．2．1 生物学分析及多肽 的设计 登录进入 ht— 能，抑制 了宿主对牛皮蝇幼虫的排斥反应 ，保证了牛 tp：／／www．nicbi．nlm．nih．gov，采 用 Blastn和 皮蝇幼虫在宿主体 内成活。HA具有很好的免疫原 Blastx程序，进行同源性和保守性分析。利用生物 性，以其作为免疫抗原，可使被免疫的动物产生对牛 信息学 DNAstar(Protean)软件对 HA 的二级结 皮蝇幼虫感染具有保护性的抗体 。利用生物学信息 构、抗