HBVX基因在HL-7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调HSP70基因的表达.pdf

J叠F辇 塑 2013October．v。147N。 ujianMedUniv … ’… ‘u 265 HBVX基因在HL一7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调 HSP70基 因的表达 陈红英 ，陈治新 ，王小众 摘要 ： 目的 研究乙型肝炎病毒 x(HBVX)基 因在肝细胞 HL一7702中的稳定表达对其细胞凋亡和表达 HSPT0的影响，并探讨二者之间的关联 。 方法 将 已构建好 的HBVX基 因真核表达载体 pcDNA3-X转染人 肝细胞 HL一7702，48h后经 G418筛选 出稳定表达 HBVX基 因的肝细胞株 (L02／HBx)。RT—PCR、蛋 白印迹实验 鉴定 L02／HBx细胞 HBVX基 因的稳定表达 。以转染空质粒肝细胞 (L02／pcDNA3)为对照，运用流式细胞分析、 TUNEL分析和 DNA ladder观察检测 L02／HBx细胞凋亡情况 。基 因芯片技术筛查 I02／HBx和 L02／pcDNA3两 组肝细胞差异表达的凋亡相关基 因，并运用蛋 白印迹实验技术对差异表达的 HSP70基 因进行蛋 白水平验证 。 结果 RT—PCR和蛋 白印迹实验显示 ，L02／HBx细胞 中有 HBVX 基 因 mRNA 和蛋 白的表达 。流式细胞 和 TUNEL分析显示 ，L02／HBx细胞组的凋亡率显著高于对照组 L02／pcDNA3，DNA ladder可观测到 L02／HBx的 凋亡现象，而对照组未观测到 。两次基 因芯片结果筛查 出L02／HBx细胞组与对照组差异表达基 因HSP70，蛋 白 印迹实验进一步证实 HSP70在 LO2／HBx细胞 中的蛋 白表达显著高于未表达 x基因的肝细胞组 。 结论 HBV x基 因在肝细胞 HL7702中的表达促进了肝细胞 的凋亡 ，上调 了肝细胞 中HSP70基 因的表达 ，从而在 乙型肝炎 病毒致肝细胞癌变的过程 中起重要作用 。 关键词 ： 肝细胞 ；肝炎病毒 ，乙型；基因，病毒 ；基 因表达 ；细胞凋亡 ；细胞 ，培养 的；癌 ，肝细胞 ；HSC70热 休克蛋 白质类 中图分类号 ： R329．24；R329．25；R373；R373．21；R394；R735．7 文献标识码 ： A 文章编号 ： 2013)O5一O265一O6 慢性乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus，HBV)感 过转染技术揭示 X基因在 HL一7702细胞 中表达后 染可导致肝炎、肝纤维化和肝细胞癌的发生 。全球 对其凋亡的影响。此外 ，已有研究证实 HSP70在细 超过 3．5亿人感染 HBV_】]，中国是乙型肝炎病毒感 胞 的损伤修复、凋亡和肝细胞癌等致病过程中起重 染的高发区。乙型肝炎病毒是双链 DNA 结构 ，有 要作用 。本研究将通过基 因芯片和蛋 白印迹实验 四个开放 区，分别称为 S、C、P及 X。大量研究发 等方法检测乙型肝炎病毒 x蛋 白(HBx)对肝细胞 现 ，HBVX基 因可以通过调节细胞增殖和凋亡 、转 表达 HSP70的影响，进而揭示其与肝细胞凋亡的关 录激活和抑制DNA的修复等途径致肝细胞癌的发 系，阐析 HBx的致病作用 。 生_l2]。然而，对于 HBVX基因对肝细胞凋亡 的影 1 材料和方法 响一直颇有争议。国内外学者通过研究指出，X基 因可 以促进肝细胞 的增殖 、抑制凋亡从而促进肝癌 1．1 主要试剂和仪器 HBVX 基 因的重组质粒 的发生，然而不少研究则发现 X基因有促进肝细胞 pcDNA3一X[、HL一7702肝细胞 (本研究室保存)； 凋亡的作用 ]。上述研究多 以HepG2等肝癌细胞 Transfast转染试剂盒 (法 国Polyplus—transfection 为研究对象，有别于 HBV在体 内感染正常肝细胞 公司)；G418和 MMLV 逆转录试剂盒 (美 国 Pro— 的病理过程 ，实验结果无法科学地解析 HBV 的致 mega公司)；B—actin蛋 白抗体 (美 国 LabVision