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重庆医学 2014年 1月第43卷第 2期 197
苏州大学附属第一医院感染科住院，男 51例 ，女 25例 ；其 中 碳酸二乙酯(DEPC)水配制]混匀，4℃，12000r／min离心 5
CHB组 24例 (男 17例 ，女 7例)，平均年龄 (58．41±2．95)岁； rain。弃上清液 ，倒置室温干燥 。加 2O L0．1 DEPC水溶
LC组 24例(男 14例 ，女 1O例)，平均年龄 (46．30±3．61)岁； 解 。所提取的总 RNA 以1：50稀释 ，用紫外分光光度计检测
HCC组 28例(男 2O例 ，女 8例)，平均年龄 (44．13±2．56)岁。 其在 260、280nm处光密度值 (OD值)比值为 1．9，在浓度为
诊断符合 2010年中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分 1．5％琼脂糖凝胶 的平板上进行 电泳，完整性 良好 。
会联合修订的 “慢性乙型肝炎防治指南 ”诊断标准 ]。对照组 1．3．3 逆转录 检测提取的总 RNA 的完整性，将 RNA逆转
(NC组)30例：本院保健科体检结果健康的人群，男 15例，女 录为 cDNA，反应体系见表 1。将上述各试剂混匀，于 Gene—
15例，平均年龄(44．39±2．45)岁，无肝炎病史、乙型肝炎标志 AmpPCRSystem9700扩增仪上 42。C 60rain，95C 5min，4
物测定均为阴性 。 C 1min进行反应 ，合成 的cDNA置一80。C保存备用 。
1．2 试剂和仪器 GeneAmpPCRSystem9700扩增仪 (美 国 表 1 逆转录反应体系
ABI公司)，lightCyclerRealTimePCR扩增仪 (RocheDiag— 试 剂种类 用量 (“I)
nostics公司)，ThermoSpeetronic紫外分光光度计 (美 国Spec—
第一链缓冲液 (5×)
tronic)，GRP一9160型隔水式恒温培养箱 (上海 民仪 电子有限公
M—MLV逆转录酶(200U／uL)
司)，eppendorf—centrifuge5430台式高速离心机 (德 国eppen—
RNAsafe(20×)
doff公司)，eppendorf_centrifuge5430R低温高速离心机 (德 国
dNTP混合液 (10mmol／I)
eppendof公司)，一80。C低温冰箱 。
Random Octamem(200U／uL)
1．3 方法
1．3．1 外周血标本单个核细胞 的分离 Ficoll淋 巴细胞分离 去RNA酶 ddHaO
液 (上海恒信化学试剂有限公司)3mL，将稀释好 的外周血用 逆 RNA
一 次性滴管吸取后 ，小心沿管壁缓缓加入淋 巴细胞分离液 (不 总体积
要摇晃、震动)，水平离心机 2000r／min离心 20min后 ，取出，
用一次性滴管吸取 中间层云雾状单个核细胞 ，加入 1．5mL离
1．3．4 标准 品制备 采用本实验室 自备的t?-actin质粒标准
心管中，10000r／min离心 1．5min，弃上清液 ，加入 1mL生理
品，分别为 3．34×10、3．34×10、3．34×
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