Influx流式仪分选肺腺癌A549细胞SP亚群的条件优化.pdf

第22卷第5期 激 光 生 物 学 报 V01．22NO．5 2013年 10月 ACTA LASER BIOLOGY SINICA 0ct．2013 doi：10．3969／j．issn．1007-7146．2013．05．006 Influx流式仪分选肺腺癌 A549细胞 SP亚群 的条件优化 周玉英，陈小佳 (暨南大学生物医药研究院，暨南大学细胞生物学系， 基因工程药物国家工程研究中心，广东省生物工程药物重点实验室，广东广州 510632) 摘 要 ：目的：通过分选肺腺癌A549细胞的侧群细胞(sidepopulationcells，SP)，了解影响Influx分选sP的各 种因素，为成功分选其他肿瘤细胞的sP亚群提供方法参考。方法：(1)细胞的制备 ：取对数生长期的细胞，制备 单细胞悬液 ，用 Hoechst33342及PI标记染色 ，同时设计维拉帕米对照组；(2)最佳分选喷嘴的确定 ：根据对数生 长期的A549细胞处于不同的分裂时象的细胞大小，预实验确定最佳分选喷嘴；(3)光信号的调试 ：用 Rainbow Beads优化670／30[355]、460／50[355]荧光信号和 FSC散射光信号，使光信号最强且变异系数(coefficientof variation，CV)最小。(4)最佳液滴延迟 的确定 ：调节振荡频率 (~equency)找 出最佳液流断点位置 ，调节振幅 (ampitude)优化侧液流信号直到两侧液流信号最稳定，DelayCalculator自动计算液滴延迟，根据AccudropBeads 的分选效果确定最佳液滴延迟 ；(5)其他指标的调整 ：调节液滴的充电电压(dropcharge)和分选装置的x、Y轴 坐标 ，使测试分选液滴准确达到分选装置 中；设置分选参数，分选 目的细胞群。结果：同一批次处理的A549肺 腺癌细胞 ，100 m的喷嘴为分选 A549肺腺癌 sP亚群的最佳喷嘴；CV值校正后 sP比例为 19．7％，提高 了 6％；液滴延迟校正后 ，其分选效率(efficiency)提高 了 15％，分选纯度 (purity)提高了23％；10~g／mL的Ho· echsd3342染色，其 sP比例是5 g／mL染色的5倍以上；细胞浓度越稀，分选效率和分选纯度相应提高；活细胞 比例越高，sP比例越高。结论 ：合适的喷嘴大小，是保证高分选效率和高分选纯度的基础 ；仪器较小的CV值和 较精确的液滴延迟、合理的Hoechst33342染料浓度、较高的细胞存活率和适中的细胞浓度是保证高分选效率和 高分选纯度的的关键 ；通过平衡上述影响分选的因素才可能得到最佳的分选效果。 关键词 ：流式分选；侧群干细胞；变异系数；效率；纯度 中图分类号：Q631；Q813 文献标识码 ：A 文章编号：1007-7146(2013)05-0423-09 TheInfluenceofInstrumentandSampleFactorsonSortingEffect ZHOUYuying，CHENXiaojia (BiomedicineInstituteofJinanUniversity，CellBiologyDepartmentofJinanUniversity，NationalEngineeringResearchCenterof GeneticMedicine，GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBioengineeringMedicine，Guangdong510632，Guangzhou，China) Abstract：0Mective：Forsuccessfulseparationofsidepopulation(SP)cellsoftumorcellsbyusingBDInfluxsorting 收稿 日期：2013-09-02；修回日期：2013-09-22 基金项 目：广