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土壤磷酸酶活性的测定 【摘要】 在植物的土壤磷素营养中，有机磷化合物占有一定的比例，而有机磷往往要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能转化成为植物可能利用的形态。所以，土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性。研究土壤的磷酸酶活性，对于弄清土壤中磷的转化过程、方向及强度具有重要意义。磷酸酶根据PH不同，分为酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和中性磷酸酶。本文主要讲述磷酸酶的活性的测定。 【关键词】 土壤磷酸酶活性 碱性磷酸酶活性 酸性磷酸酶活性 中性磷酸酶活性 pH5醋酸盐缓冲液 pH7柠檬酸盐缓冲液 pH9.4硼酸盐缓冲液 标准曲线的测定 酸性磷酸酶标准曲线的测定 碱性磷酸酶标准曲线的测定 中性磷酸酶标准曲线的测定 【正文】 在植物的土壤磷素营养中，有机磷化合物占有一定的比例，而有机磷往往要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能转化成为植物可能利用的形态。所以，土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性。研究土壤的磷酸酶活性，对于弄清土壤中磷的转化过程、方向及强度具有重要意义。 1.酸性磷酸酶活性的测定 实验原理 本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量，用以表示酸性磷酸酶活性。 试剂配制 （1）0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）； pH5醋酸盐缓冲液； （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用； （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中； 酚工作液——取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）； （5）甲苯； （6）0.3％硫酸铝溶液。 （三）实验步骤 （1）标准曲线绘制 取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mLpH5醋酸盐缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。30min后比色测定。绘制标准曲线。 （2）土壤酸性磷酸酶的测定 称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL 0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。后于培养液中加100mL 0.3％硫酸铝溶液并过滤。 吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。 酸性磷酸酶活性，以37℃下24h后1g土壤中释放处的酚的毫克数表示。 实验结果记录 酸性标准曲线的测定 浓度/mg·g-1 0.0002 0.0006 0.0010 0.0014 0.0018 0.0022 0.0026 吸光度 土壤酸性磷酸酶的测定 吸光度为： 2.碱性磷酸酶活性的测定 实验原理 本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量，用以表示碱性磷酸酶活性。 试剂配制 （1）0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）； （2）pH7柠檬酸盐缓冲液； （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用； （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中； 酚工作液——取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）； （5）甲苯； （6）0.3％硫酸铝溶液。 （三）实验步骤 （1）标准曲线绘制 取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mLpH7柠檬酸盐缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。30min后比色测定。绘制标准曲线。 （2）土壤碱性磷酸酶的测定 称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL 0.5％磷酸苯二钠，仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。后于培养液中加100mL 0.3％硫酸铝溶液并过滤。 吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。 酸性磷酸酶活性，以37℃下24h后1g土壤中释放处的酚的毫克数表示。 实验结果记录 酸性标准