蛋白分离纯化操作及策略.ppt

蛋白质分离纯化策略 蛋白质分离纯化策略 生化学家分离未知蛋白 规模较小，目标蛋白含量往往极低 各步骤用活性分析和蛋白物理化学分析严密监控 针对性强，过程复杂 产物纯度要求高，往往用户测序 基因工程下游分离已知蛋白 规模较大，目标产物含量较高 重视纯化过程的技术经济指标 有较强的针对性 产物纯度要求高，通常有特殊的要求 分子生物学实验室分离已知蛋白 规模小 目标产物含量较高，往往高表达产物，大于5％ 纯度和回收率往往要求较低，电泳纯 方法比较简单，往往在2步以内，亲和层析是最常用的手段 硬件结构有通用性 蛋白质纯化一般步骤 样品准备 捕获 中间纯化 精纯 层析的目标 目标 纯度，Purity (90% vs. ≥ 99.9%) 活性，Activity (active vs. inactive) 含量，Quantity (ng or mg levels) 关键杂质的对数减少，Log reductions of key contaminants 必须了解的蛋白特性 分子量与等电点 pH、温度稳定性，pH, temp stability 盐、去污剂、有机溶剂和金属离子的影响 Effects of salt, detergents, organic solvents, metal ions 翻译后修饰，Post-translational modifications 选择层析类型 技术类型 变性/非变性，Denaturing/non-denaturing 分辨率，Resolution 得率，Yield 速度，Speed Before Starting… 蛋白质纯化策略 纯度 时间 得率 活性 各步骤的评价参数 纯度 得率 生物活性 工艺时间 工艺策略 各步骤的评价方法 电泳：SDS，PAGE 蛋白质浓度测定 生物活性测定 捕获: 快速去除关键杂质，例如能降解目标蛋白的组分，如蛋白酶等，浓缩样品，去除高峰度杂质蛋白 中间纯化: 去除大部分残留的杂质蛋白 精细纯化： 去除与目标蛋白性质接近的残留少量或微量杂质蛋白 工艺策略 工艺策略 菌液分离，澄清 脱盐 捕获 中间纯化 精纯 浓缩 离子交换 亲和 CHT羟基磷灰石 疏水 亲和 离子交换 凝胶过滤（分子筛） 亲和 80－120um 40－80um 10－50um 层析介质颗粒大小 Affinity——IEX——CHT 纯化mAb 工艺路线选择 原理 Protein A to remove the bulk of HCP, DNA, endotoxin, virus. UNOsphere Q to remove retrovirus, polish DNA, endotoxin, and HCP. CHT to remove leached protein A and IgG aggregates, polish other contaminants. 1 Affinity——IEX——CHT 纯化mAb 工艺路线选择 Protein A CHT UNOsphere Q 4 1 2 3 1 2 3 4 5 2 4 5 0 S HPSEC Bio-Silect SEC 400-5 50mM Hepes 0.5M NaCl 2M urea, pH 7 1 Expression of the Yeast recombinant protein X 175 83 66 48 35 25 17 7 M 1 2 3 4 5 6 M：蛋白预染分子量标准 1-5：诱导1-5天X蛋白表达条带 6：空载体诱导表达条带 许望翔 军事医学科学院放射医学研究所 2 Separation on CHT Type I 前期，我们通过先后运用0-1mol/L NaCl梯度和5-500mmol/L Na3PO4的盐梯度进行双梯度洗脱，发现X蛋白能够在大于0.4mol/L NaCl浓度下被完全洗脱下来（结果未给出）。 2 SDSanalysis of CHT separation fractions 170 130 95 72 55 43 35 26 17 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M：蛋白预染分子量标准 1：超滤