蛋白质分离与纯化.ppt

S与蛋白质大体上和分子量成正比关系。 S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大－沉降慢。 应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。 Isopycnic Equilibration (CsCl等密度平衡) Zone Centrifugation (蔗糖区带离心) 高 速 离 心 Gravity Centrifugation (无梯度) 高速离心与两种超高速离心法的比較 样品：多为蛋白质 密度相似、分子量不同 样品：多为核酸 密度不同、分子量相似 一般的重力离心仅把 颗粒与溶液分离开來 超 速 离 心 (Supercoiled) RNA Plasmid DNA (Open circular) Chromosomal DNA Protein Density Density Density Density Lipids (浓度梯度) 沉 降 方 向 沉 降 方 向 密度梯度离心 滴加样品 4% 8% 12% 16% 20% 塑料离心管 蔗糖密度梯度 （介质还可用：氯化铯、甘油等） 蔗糖浓度% 分子量由小 —————? 大 用氯化铯密度梯度超速离心两天后，在紫外线照射下。 可观察到质粒DNA的明亮荧光条带。 蛋白质（酶）的分离纯化 性质 方法 分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 电荷 电泳、离子交换层析 吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析） 对配体分子 亲和层析 的生物亲和力 组合纯化 硫酸铵沉淀 凝胶过滤法 离子交换法 分子表面极性不同 分子量大小不同 分子静电荷不同 第四节 纯度鉴定 生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。 蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。 纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。 选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2~3种不同的方法才能确定。 蛋白质的定量分析 考马斯亮蓝法 (Bradford法) Folin－酚试剂法 (Lowry法) 紫外吸收法 双缩脲法 (Biuret法) 凯氏定氮法 (Kjedahl法) 利用蛋白质的呈色反应，测量蛋白质浓度。 双缩脲反应： Cu2+ 蛋白质 紫色络合物 OH- 蛋白质的呈色反应 颜色反应→光吸收→定量分析 双缩脲试剂加入前的尿液样。 阳性(+) 阴性(-) 未知样A，B和C 颜色反应→光吸收→定量分析 酚试剂反应： 磷钨酸 蛋白质 蓝色化合物 磷钼酸 蛋白质的呈色反应 米伦试剂反应： 米伦试剂 蛋白质 红色沉淀 △ 颜色反应→光吸收→定量分析 蛋白质的呈色反应 考马斯亮蓝反应： 考马斯亮蓝 蛋白质 （R-250）红蓝色 （G-250）蓝绿色 R250较敏感，定量实验用，染胶效果较好，但脱色较难 。 G250常用的蛋白染料，定性试验用。 颜色反应→光吸收→定量分析 蛋白质的呈色反应 考马斯亮兰法 (Bradford法) G250 465nm → 595nm 标准曲线 标准蛋白 蛋白质 (μg) A750 0 20 40 60 80 100 0.000 0.120 0.254 0.372 0.480 0.601 利用蛋白质的吸光度，测量蛋白质浓度。 标准曲线 未知蛋白 蛋白质 (μg) A750 33 92 0.200 0.550 酶的活力测定 在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。 酶活力：催化反应的能力，表示样品中酶 的浓度(u/mL酶液)； 回收率：提纯前