高中生物核心概念高考复习课件-蛋白质提取和分离.ppt

凝胶色谱操作 （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 注意： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙 * 能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因是不同蛋白质在许多理化性质上有着极大的不同。 这些理化性质的不同是由于氨基酸的数目和序列不同造成的。 蛋白分离的方法 与蛋白质分离相关的理化特性 分子大小 分子形状 带电特性 溶解特性 与配体特异性结合不同 吸附性质 变性和复性 分子大小 大小 蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。 几百—百万 Da 常用方法 透析 超滤 凝胶过滤 离心 透析法 分子形状 形状 形状的不同会导致蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到它的形状的影响。 方法 梯度离心的影响 电泳的影响 电荷 原理 蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。若天冬氨酸和谷氨酸占优势，在pH 7.0时带净负电荷，称为酸性蛋白质。若赖氨酸和精氨酸占优势，在pH 7.0时带净正电荷，称为碱性蛋白质。 方法 电泳 离子交换层析 溶解度 原理 由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。 方法： 通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 配体特异性结合 原理 生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。 方法 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。 变性和复性 原理 蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。 方法 尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白 提取分离原则 尽可能多地提取目的蛋白，同时避免因热、 pH或有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素造成活性丢失。 选择合适的pH、选择合适的离子强度 选择合适的比例 提取液成分的确定 pH 缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬酸-柠檬酸钠 离子强度：动物 NaCl, 植物KCl 还原剂:2-巯基乙醇 蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF, TPCK,TLCK 金属离子螯合剂: EDTA, EGTA 温度 0-4℃ 常用的实验技术：凝胶色谱法和电泳 凝胶色谱法原理 以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。 凝胶介质 葡聚糖 （glucose） 琼脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（acrylamide） 凝胶色谱法 电泳（ Electrophoresis ） 电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。 蛋白质常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异，分子量大小与迁移率成正比 。 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。 目标 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 了解缓冲液的组成及其作用 血红蛋白的分离－样品处理 重点 凝胶色谱法的原理 难点 电泳法分离大分子的原理 凝胶色谱法原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（