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酵母核糖核酸的分离及组分鉴定初步

离心机原理和应用 离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力,加快液体中颗粒的沉降速度,把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开 。 rpm — revolutions per minute 每分钟转数 RCF--- Relative centrifugal force 相对离心力,是指在离心场中,作用于颗粒的离心力相当于地球重力加速度g的倍数 4000rpm 4000g RCF = 1.119×10-5×(rpm)2 r 其中r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离单位为cm。由于离心管的位置由转子(rotor)决定,因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。 使用注意:配平! 离心参数调节:转头,转速和离心时间 核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA) 由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名。 RNA的种类:mRNA,tRNA和rRNA,另外snRNA(2006年诺贝尔医学奖)。 实验原理 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,离心除去蛋白质和菌体后,上清液用乙醇使RNA沉淀,由此即得到RNA粗制品。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分,加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以鉴定上述的组分。 RNA组份鉴定 (1)嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 (2)苔衣酚显色法:核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与苔衣酚(3,5-二羟基甲苯)反应呈鲜绿色,该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。 (3)磷酸与定磷试剂中的钼酸铵作用生成磷钼酸,并被Vc还原成蓝色的的复合物钼蓝。 强酸 、强碱、 沸水浴,注意安全! 下次实验: 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法) 实 验 四 酵母RNA的分离及其组分鉴定 ( 离 心 技 术 ) 实验目的 1、学习稀碱法提取酵母RNA粗制品的原理和方法。 2、了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。 3、学习离心机的使用方法。 核苷-5′-磷酸 酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,含量为干菌体的2.67%-10.0%,而DNA含量仅为0.03%-0.516%。 工业上制备RNA多选用成本低、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备单核苷酸的原料,其工艺比较简单。 应用领域:调味品和食品添加剂 实验仪器 1.研钵 2.水浴锅 3.量筒 4.滴管 5.试管及试管架 6.烧杯 7.离心机 8.锥形瓶 试剂和材料 1. 0.04mol/L氢氧化钠溶液 6.定磷试剂 2.三氯化铁浓盐酸溶液 7.酸性乙醇溶液 3. 0.1mol/L硝酸银溶液 8.苔黑酚乙醇溶液 4. 1.5mol/L硫酸溶液 9.酵母粉 5.浓氨水 操作步骤 (一)酵母RNA粗制品的提取 1、将酵母片在研钵中研磨均匀,称取4g酵母粉悬于30mL 0.04mol/L NaOH溶液中(锥形瓶)。在沸水浴上加热30分钟后,冷却。 2、4000r/min离心5分钟后,分成上清和沉淀两层,沉淀主要成分就是变性的蛋白质,RNA包含在上清中。 3、将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后,离心(4000rpm)5分 钟。弃去上清液。 注:离心前,离心管(包含转头)一定要对称的两管在天平上配平,第一次用NaOH溶液,第二次用酸性乙醇。 两次使用的胶头滴管要分开放置 (二)组分鉴定 1、水解:提取的核酸溶解于10mL 1.5mol/L硫酸溶液中,在沸水浴中加热10min制成水解液,进行组分的鉴定 。 2. 嘌呤碱:取一只试管,加入1ml水解液,加入过量的浓氨水(用胶头吸管吸2管约2ml),再加入1 ml 0.1 mol/L硝酸银,观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀生成。 嘌呤银络合物在碱性条件下易形成白色絮状沉淀。 3. 核糖:取一只试管,加入水解液1ml,三氯化铁浓盐酸溶液2ml,加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml,放入沸水浴中5min。注意溶液是否变墨绿色。 核糖在浓盐酸中,与苔黑酚(3,5-二羟甲苯)及三氯化铁盐酸试剂共热,产生绿色的络合物。 4. 磷酸:取一只试管,加入水解液1ml和定磷试剂1ml,在沸水浴中加热。观察溶液是否变成蓝色。 磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸,磷钼酸在还原剂抗坏血酸(Vc)的作用下形成蓝色复合物钼蓝。 1. 稀碱法提取的RNA为变性RNA,可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备,不能作为

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